免疫组化原理及步骤
免疫组化操作规程一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜包括荧光显微镜、电子显微镜的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等。二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。
三、试剂配制
f1001MPBSpH734：90gNaCl50ml02MPB加双蒸水至1000ml；1000ml02MPBpH74＝593gNaH2PO42H2O＋5802gNa2HPO412H2Oi
1000ml双蒸水或＝190mlA810mlB（A02MNaH2PO42H2O：156gi
500mlddH2O；B02MNa2HPO412H2O：71632gi
1000mldH2O）。2CitrateBufferedSali
e（001M柠檬酸缓冲液，PH60）：28mlA72mlB200mlddH2O（ACitrateacid（柠檬酸）：105g加双蒸水至1000ml；BCitratesodium（柠檬酸钠）：2941g加双蒸水至1000ml）。3细胞通透液：由终浓度分别为03双氧水和03Trito
X100混合而成。配制方法是先用微波加热的36mlPBS，再接着加120ulTrito
X100
f并加热一儿，冷却至临用前加04ml30％H2O2。45％羊血清或封闭血清，用PBS稀释。5含003％H2O2的005％DAB（避光）：用20×DAB（1％，10mgml）5ul＋01ul30H2O2＋95ulPBS。6一抗、二抗均用PBS稀释。7Xyle
e、梯度Etha
o（l100％×2、95％、80％、70％、50％）、双蒸水、中性树胶（封裱剂）。8苏木精染液：四、操作步骤
1、脱蜡、水化
160℃×20mi
→Xyle
e2×10mi
utes；2100absoluteetha
ol：2×5mi
utes；395etha
ol2mi
utes；480etha
ol2mi
utes；
f570etha
ol2mi
utes；6distilledwater5mi
；7PBS洗3次×3mi
。
2、细胞通透、封闭内
源性过氧化物酶
8用封闭通透液浸润切片30mi
（RT避光）。配法是用预热40mlPBS加120ulTrito
X100加热几分钟后，临用前加400ul30％H2O2。9PBS溶液洗3次×3mi
。
3、抗原修复暴露抗原
决定族
10切片放入001M柠檬酸钠缓冲溶液（pH60）后，在微波炉里高火4mi
至沸腾后，再加热约6mi
×4次，每次间隔补足液体，防止干片。
4、封闭非特异性蛋白
f11PBS溶液洗3次×3mi
；12将切片取出周围水分用滤纸吸干用组化笔在组织周围画上圈在圆圈内组织滴入5羊血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中室温30（10～30）mi
；
5、一r