抗孵育
13甩去切片上的羊血清用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（1：250、500、1000）后，放入湿盒中室温1小时，然后4度过夜，从冰箱中取出需37℃复温45mi
。
6、二抗孵育
14将一抗倒掉并用PBS洗5mi
×5次；15用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入37℃恒温烤箱中30mi
（回收）。16用PBS洗5次×5mi
；
7、SP反应
f17加入SP后放入37度烤箱中30mi
。18用PBS洗5次×5mi
；
8、显色
19加入DAB（快速滴入，观察染色情况，倒掉染液），显色时间控制在约5mi
（3～10mi
），由镜下观察颜色控制时间。005％DAB（避光）（120储备液）：5ul20×DAB＋01ul30H2O2＋95ulPBS。1DAB储备液的制50mgDAB5ml005molLPBS充分溶解，20℃保存。
9、复染、脱水、透明、
封片
20用PBS3次×3mi
后，用双蒸水洗5mi
；21加一大滴苏木素染液，胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋白染20s后自来水冲洗，
f双蒸水洗5mi
，再用PBS返蓝5mi
。22脱水：50etha
ol12mi
，
70etha
ol12mi
95etha
ol12mi
；95etha
ol12mi
；100absoluteetha
ol12mi
；100absoluteetha
ol12mi
。23透明：Xyle
e1×12
mi
→Xyle
e2×12mi
24封片：中性树胶。
五、注意事项
1苏木素复染时间需要摸索，尤其阳性染色也在细胞核上。2DAB显色时间需要达到最优化，镜下观察达到阳性染色明显但背景不太深。3抗体孵育时间和抗体浓度需要摸索。尤其一抗孵育最好在4度过夜。
f4切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加液前甩干洗涤液，但又防止干片；用组化笔画圈时尽量画大一点，否则墨水排斥液体，引起片周边干片。5片子着色不均匀的原因如下：①脱蜡不充分。可以60℃烤20mi
，立即放入新鲜的xyle
e1；②水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇；③抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗二抗等试剂；④抗体孵育时，切片放倾斜；⑤抗体孵育后PBS冲洗不充分。⑥制片厚薄不均匀等问题。染片盒不平，切片倾斜。6一抗从4℃拿出后，为什么有人说要37度复温，目的是什么？①一方面，防止切片从4℃直接放入PBS易脱片；②另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要但对表达较弱的抗原可能有用4℃和37℃度
f时分子运动方式不同前者分子碰撞机率和运动速度小于后者后者结合更快但敏感性也提高了并易造成非特异染色。7切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？①抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗二抗孵育r