聚合酶链反应技术、实验二聚合酶链反应技术、酶切鉴定
第一节聚合酶链反应技术
目的：目的：1．了解PCR基因扩增技术在DNA操作中的重要性及应用范围。2．熟悉PCR基因扩增的基本原理。3．掌握PCR基因扩增技术的具体操作过程。原理：原理：聚合酶链反应技术（PCR技术）实际上是在模板DNA、引物和四种dNTP存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促反应。在反应中混合下列物质：模板DNA、四种dNTP包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP、引物1、引物2、TaqDNA聚合酶、缓冲液及Mg2MgCl2，然后经下列过程大量扩增靶DNA，类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性－退火－延伸三个基本反应步骤构成。试剂：试剂：（1）TaKaRaTaq5Uml（2）10×PCR缓冲液Mg2Plus（3）dNTP混合液each10mM（4）DNA模板10
g（5）引物
引物名称引物序列5′－3′3的位置
tMit1FMit1RMit2FMit2RCTCCTCAAAGCAATACACTGTGCTAAATCCACCTTCGACCCGATCAACCTCACCACCTCTTGGACAACCAGCTATCACCA61114111245200758802复性温度℃58802204产物长度bp相互覆盖长度bp
操作步骤：操作步骤：用1在一个无菌的05mLEppe
dorf离心管内加入PCR混合液25l混匀，100l
f矿物油覆盖于反应混合液之上，以防止反应过程水分蒸发。PCR反应体系：
反应体系各成分名称PCR缓冲液dNTPMgCl2前向引物反向引物Taq聚合酶模板DNAddH2O合计反应体系各成分浓度10×200
molL25umolL10umolL10umolL5Uul50
gul各成分体积（l）2020150202011018025
2．将Eppe
dorf离心管放入PCR仪反应仓中。3．设置PCR反应条件为：
94℃5mi

94℃10s30cyclesTa30s72℃1mi
72℃5mi
4℃∞
4．PCR产物分析：采用12％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量、引物扩增的特异性，根据标准DNA的量粗略计算PCR产物的总量，电泳方法见实验一质粒DNA的琼脂糖电泳。注意事项：注意事项：1．用PCR扩增目的基因，一般多采用商品试剂盒。若自己配制试剂，配好后必需高压灭菌。2．用于PCR扩增的模板DNA一定要纯，以防止反应体系被痕量非目的基因模板污染。3．吸加PCR试剂时戴上新塑料手套，并在超净工作台上操作，避免操作不当建成污染。常见问题及分析PCR常见问题及分析
f1．假阳性PCR反应十分灵敏，极微量的模板污染就可以造成假阳性的出现，操作人员身体表面、阳性标本、实验室的一切试剂、器材及仪器或者其它与扩增产物接触的物品都是潜在的污染源，从标本的采集、运输、处理过程到PCR的操作应严格遵守操作规程。为r