年了。以培养为基础的方法被长期接受并获得普遍成功，但是这些技术费时费力，而且在某些情况下不一定能提供微生物群落组成的可靠信息。未知的和不可培养的种的出现以及样本的混合和稀释步骤会对微生物的生存能力产生影响，能够导致对产品真实生态学组成的失真的观察（Fleet，1999）。而且，在不利条件下，比如营养耗尽、低温和其他压力，某些微生物能进入可生存的但不可培养（VNC）的状态。VNC状态的微生物仍然具有新陈代谢活性但是不能在通常支持它们生长的培养基上形成菌落，因此它们不能被传统的方法发现。为了克服这些问题，免培养法比如变性梯度凝胶电泳温度梯度凝胶电泳（DGGETGGE）、单链构象多态性（SSCP）、荧光原位杂交（FISH），或者以PCR为基础的技术比如长度异质PCR（LHPCR）和末端限制性片段长度多态性（TRFLP）在过去几年得到发展（Giraffaa
dNevia
i2001）。TRFLP是一种分析不同细菌的16srRNA的差异，并提供微生物种群结构信息的方法（Osbor
et。单独的末端限制al2000）它是以限制性核酸内切酶消化荧光末端标记的PCR产物为基础的。性酶切片段（TRFs）被电泳分开并由荧光信号亮度量化。依靠微生物群落的物种组成，获得明显的外形（TRF图案），一种代表一个物种的存在。一个相对定量的分布可以获得，因为每个顶点的荧光密度是和混合物中每个物种的DNA量成比例的。然而，PCR的偏差可能对微。生物群落真实组成的量化产生消极的影响（Suzukia
dGiova
o
i1996Suzukietal1998）以DNA为基础的方法的缺点是不能区分活的和死的生物体，因为溶解细胞中的DNA能够。因此，以DNA为基础在自然环境中存在很长时间（Be
tsi
ketal2002Wolffsetal2005）的PCR不能区分生活的、VNC和死细胞，这就限制了它用于监控目的的使用（Sherida
etal1998）。在死细胞中RNA比DNA降解的快（Va
derVlietetal1994），因此，逆转录酶PCR（RTPCR）可能是生存能力、新陈代谢活力和细胞完整性的一个好的指示器（Be
tsi
ketal2002）。这项工作的目的是检验与RTPCR相连系的TRFLP监控确定微生物种群（比如乳品确定菌株的初始物）的新陈代谢活性部分的群体动力学的能力。在这一点上，研究了整个发酵过程中两种确定菌株的初始物的成分的演变。为了减少PCR的偏差，这种方法被最优化并且检验了它的可重复性。
2．材料与方法21细菌菌株和生长条件
f微生物发酵工程案例教学
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本研究中使用的细菌菌株包括从人工奶酪中分离的两株柠檬明串珠菌菌株（IPLA621和IPLA1687）和一株乳酸乳球菌乳酸亚种菌株（IPLr