应约需酶量0525U50ml，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
（3）dNTP的质量与浓度：dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTrisHCL的缓冲液将其PH调节
到70～75，小量分装，20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umolL，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等等摩尔配制，如其中任何一种浓度不同于其它几种时偏高或偏低，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。
（4）模板靶基因核酸：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和
蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。
（5）Mg2浓度：Mg2对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umolL时，
Mg2浓度为15～20mmolL为宜。Mg2浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
RTPCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。
①总RNA提取（70℃保存）
Trizol法：1、取组织100于玻璃匀浆器中，加入1mlTrizol冰上抽打匀浆（边匀浆边暂停）2、移入15mlEP管中，颠倒混匀，室温保存5mi
3、加氯仿02ml（总体积的15），振荡混合，室温放置5mi
4、4℃，离心12000rpm，15mi
5、取上层液相（约400μl）移入一新15mlEP管中，加等体积异丙醇（约400μl）振荡混合，室温保存10mi
6、4℃，离心12000rpm，10mi
7、弃上清液，加1ml75无水乙醇（4℃保存），振荡混合8、4℃，离心7500rpm，5mi
9、弃上清液，室温放置20mi
EP管倒置在滤纸上使RNA沉淀干燥（不能完全干燥）10、加20ulDEPC水至EP管中，在60℃孵育35mi
或手握35mi
使RNA充分溶解（可保存在液氮或低温冰箱70℃）
测RNA浓度：走RNA变性电泳观察18s、28s条带，分光光度计检测260280吸光度比值调零：750ulDEPC水测量：745ulDEPC水5ulRNA总RNA浓度OD260×40×稀释倍数（150倍）ugmlOD260×40×150ugmlOD260×6ugulA1A2应在1820之间注意：提取RNA的质量主要是要通过260280的比值看是不是在20左右，当OD260OD28018时提示有蛋白或酚的污染，需
要进一步纯化RNA；r