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有较多杂质,需经过重新悬浮和再离心若干次,才能获得较纯的分离产物。差速离心主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒。操作简单方便,但分离效果较差。2.密度梯度离心密度梯度离心是样品在密度梯度介质中进行离心,使密度不同的组分得以分离的一种区带分离方法。密度梯度系统是在溶剂中加入一定的梯度介质制成的。梯度介质应有足够大的溶解度,以形成所需的密度,不与分离组分反应,而且不会引起分离组分的凝聚、变性或失活,常用的有蔗糖、甘油等。使用最多的是蔗糖密度梯度系统,其梯度范围是:蔗糖浓度560,密度102130gcm3。密度梯度的制备可采用梯度混合器,也可将不同浓度的蔗糖溶液,小心地一层层加入离心管中,越靠管底,浓度越高,形成阶梯梯度。离心前,把样品小心地铺放在预先制备好的密度梯度溶液的表面。离心后,不同大小、不同形状、有一定的沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成若干条界面清晰的不连续区带。各区带内的颗粒较均一,分离效果较好。在密度梯度离心过程中,区带的位置和宽度随离心时间的不同而改变。随离心时间的加长,区带会因颗粒扩散而越来越宽。为此,适当增大离心力而缩短离心时间,可减少区带扩宽。3.等密度离心将CsCl2、CsSO4等介质溶液与样品溶液混合,然后在选定的离心力作用下,经足够时间的离心,铯盐在离心场中沉降形成密度梯度,样品中不同浮力密度的颗粒在各自的等密度点位置上形成区带。前述密度梯度离心法中,欲分离的颗粒未达到其等密度位置,故分离效果不如等密度离心法好。应当注意的是,铯盐浓度过高和离心力过大时,铯盐会沉淀管底,严重时会造成事故,故等密度梯度离心需由专业人员经严格计算确定铯盐浓度和离心机转速及离心时间。此外,铯盐对铝合金转子有很强的腐蚀性,故最好使用钛合金转子,转子使用后要仔细清洗并干燥。三、离心条件的确定离心分离的效果好坏与诸多因素有关。除了上述的离心机种类、离心方法、离心介质及密度梯度等以外,主要的是确定离心机的转速和离心时间。此外还要注意离心介质溶液的pH值和温度等条件。
f1.离心力物质颗粒在离心场中所受到的离心力(Fc)的大小,决定于颗粒的质量m和离心加速度acFcmac离心加速度的大小取决于转子的转速和颗粒的旋转半径:acω2r式中ω:转子的角速度(rads);r:旋转半径,即颗粒到旋转轴中心的距离cm。若转速以惯用的每分钟转数(rmi
)来表示,则:式中
转子每分钟转数(rmi
)在说明离心条件时r
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