热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成能量来源于dNTP2序列未知建立基因文库：建立一个包括目的基因在内的基因文库保存在受体菌中，再从基因文库中获取3目的基因大量扩增分子水平的克隆①利用受体细胞（如Ecoli）无性繁殖，利用基因探针钓取，再导入最终受体细胞eg目的基因→大肠杆菌→农杆菌→植物细胞→植物（主要在细菌分裂时几何级扩增，尽管质粒独立于拟核，可在分裂时发生自我复制，但由于多数细菌对胞内质粒数量有限制，故该种复制对扩增效果不大）②PCR技术第二步：形成重组DNA分子（基因表达载体：启动子＋目的基因＋终止子＋标记基因）1目的：转运目的基因，并使在受体内稳定存在、复制、表达转录并稳定遗传（基因型X0）2过程：（1）单酶切：用同种限制酶分别切割目的基因和载体从而形成相同的粘性末端，然后用DNA连接酶将目的基因和载体连接起来有时用不同限制酶也可以形成相同的粘性末端（2）双酶切：用两种限制酶切割使目的基因和载体两端各形成两种粘性末端，防止载体和目的基因自身环化第三步：将重组DNA分子导入受体细胞需将目的基因整合到动植物细胞的染色体DNA上目的基因是否整合到染色体DNA上决定于基因表达载体上是否有相关序列（形成酶）1植物体细胞：农杆菌转化法（插入Ti质粒上的TDNA），基因枪法、花粉管通道法导入叶绿体DNA中，由于细胞质器DNA的遗传与性别相关联，故可避免因花粉传播而造成基因污染（目的基因传播到非转基因生物中）2动物受精卵：显微注射技术用（如显微注射）技术方法将目的基因导入cf转基因基因工程技术23原核细胞：CaCl2Ca处理法（先用Ca2处理增加细胞壁通透性，使之成为感受态细胞，再将重组质粒与感受态细胞混合，在一定温度下感受态细胞吸收DNA分子）原核生物作为受体细胞的原因：①繁殖快②体积小新陈代谢旺盛（目的产物合成效率高）③遗传物质少（便于操作）、④单细胞（容易培养）第四步：筛选含有目的基因的受体细胞1原因：受体细胞接纳重组DNA分子存在概率2原理：载体如质粒上的抗性基因等标记基因3方法：利用选择培养基筛选①蔗糖转运蛋白：仅以蔗糖作为碳源的培养基②菌落表现型：抗……不抗……第五步：目的基因的检测和表达目的基因导入受体细胞可能仅进行大量扩增，但不一定以此为目的1DNA核酸分子杂交技术
f用cDNA作为探针与从受体细胞中提取并解旋的DNAmRNA杂交，观察是否会出现杂交带检测①染色体DNA上r