验重复6次。
123细胞核蛋白提取至预定时间点时胰酶处理和收集贴壁培养的细胞，低速离心，用冷PBS冲洗1次，按照蛋白抽提试剂说明书依次加入蛋白抽提液、蛋白酶抑制剂和DTF二硫苏糖醇，收集细胞裂解产物并高速离心，提取细胞核蛋白，加入考马斯亮蓝G250染液，Bradford法测定蛋白浓度。将上述细胞提取液调整蛋白浓度至100μgml1，标本分装后一70度冻存。以上操作均在冰上进行。
124凝胶电泳迁移率分析EMSA实验测定NFKB活性1双链寡核苷酸探针的标记：依次加入寡核苷酸探针175pmolμl12μl，10×T4多核苷酸激酶缓冲液1μl，T4多核苷酸激酶10uμl1lμl，γ32PATPATP037GBqml140μl，无核酸酶水2μl，将10μl反应混合液置37度孵育45mi
。再向上述反应体系中加入1μl的T4连接酶，37度下孵育10mi
，加入1μlEDTA05molL1终止反应，然后加入89μlTE缓冲液10mmolL1TrisHCl，1mmolL1EDTA，pH80。20度保存标记的探针。2核蛋白样本NFKB活性测定：按照GelShiftAssaySystems说明书，2μl核蛋白提取液和5倍的结合缓冲液混合后于37度孵育10mi
，再加入1μl标记寡核苷酸探针于37度反应45mi
。DNA蛋白复合物经4％聚丙烯酰胺凝胶于240V电泳40mi
，取出凝胶，烘干，放入片盒，压x线片，70度放射自显影10h。在凝胶电泳率实验中设特异性和非特异性竞争性对照，即在反应体系中加入200倍未标记的特异性NFKB探针和未标记的转录因子sPl序列寡核苷酸探针，室温下置10mi
后加入标记探针再孵育电泳。将显影结果经扫描仪扫入计算机中，进行密度扫描及面积积分，以灰度积分值对NFKB活性进行半定量。
13
统计学处理
f灰度积分值表示，数据采用SPSS130统计软件进行单因素方差分析，P＜005认为差异有统计学意义。
2
结果
21
NFKB竞争抑制实验
采用未标记的转录因子SP1序列寡核苷酸探针进行非特异竞争，未标记的NFKB结合序列寡核苷酸探针进行特异性竞争试验，非特异性竞争不能抑制结合反应，而特异性竞争试验明显抑制结合反应，表明这一结合反应为NFKB特异性。
22
各A
gⅡ浓度组在0、05、1、2、4h对NFKB活化的影响
EMSA结果显示：与对照组0h比较，在A
gⅡ刺激后各A
gⅡ浓度组HPMEC的NFKB活化水平有不同程度升高。A
gⅡ108molL1浓度组在4h后HPMEC的NFKB活性才开始发生显著升高P＜005；A
gⅡ107。molL1浓度组在1hHPMEC的NFKB开始发生显著性的核转位，2h持续上升，NFKB活化水平在4h时仍呈上升趋势与2h比较，P＜005；A
gⅡ106molL1浓度组1h时HPMEC的NFKB发生r