卫生化学实验七高效液相色谱法（HPLC）测定饮料中山梨酸和苯甲酸
一、实验目的与要求
1、掌握高效液相色谱法测定饮料中苯甲酸和山梨酸的原理和方法2、了解高效液相色谱仪的基本结构和使用方法3、熟悉饮料样品的处理方法
二、实验方法与原理
苯甲酸和山梨酸广泛用于食品防腐剂，能够引起人的再生障碍性贫血，粒状白细胞缺乏等。因此国家严格限制其使用量。在本实验中，样品首先经过超声和加热除去二氧化碳和乙醇，然后过滤注入高效液相色谱仪，经反相C18液相色谱柱分离后，紫外检测器230
m波长处检测。以色谱峰的保留时间定性，色谱峰面积在一定范围内与浓度呈线性关系进行定量分析。
三、实验仪器与试剂
1、仪器：高效液相色谱仪（Waters，美国）：2487紫外检测器、1525高压输液系统、717进样系统、WatersBreeze色谱工作站；超声震荡仪；100ml烧杯（1个）；1ml和100μl移液枪；离心管若干个；离心管架；微孔滤膜（022μm）。
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2、试剂：（1）甲醇（色谱纯）；醋酸铵溶液（002molL，色谱纯）；流动相分别超声脱气（10mi
）（2）山梨酸储备溶液10mgml）：准确称取02500g山梨酸，加超纯水定容至250ml。（3）苯甲酸储备液（10mgml）：准确称取02500g苯甲酸，加超纯水定容至250ml。
四、实验步骤
1、样品处理碳酸饮料（雪碧）：吸取10ml碳酸溶液超声5mi
，然后用微孔滤膜（022
μm）过滤，滤液备用。吸取100μl滤液于离心管中，并加入900μl超纯水，混合均匀标记为样品。
2、配制标准溶液（1）取一定量的苯甲酸储备液，经滤膜过滤于离心管中。吸取滤液50μl于另一离心管并加入950μl超纯水，得到50μgml的苯甲酸标准品，做好标记。（2）同理得到50μgml的山梨酸标准品，做好标记。（3）混合标准品配制：分别吸取500μl过滤后的苯甲酸和山梨酸储备液于离心管中混合均匀，得到500μgml的混合标准品。吸取50μl混合标准品（500μgml）于离心管中并加入950μl超纯水，得到25μgml的混合样，标记为混标。
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3、色谱条件：色谱柱：C18反相键合色谱柱流动相：甲醇002molL醋酸铵溶液（595）流速：1mlmi
检测波长：230
m进样量10μl
4、标准品和样品测定（1）分别进苯甲酸（50μgml）、山梨酸（50μgml）标准品，确定保留时间。
（2）记录混合标准品（25μgml）的峰面积并按下式计算样品中苯甲酸和山梨酸含量：
计算方法：CxF×Cs×Ax÷As式中：Cx为样品中被测物的含量（μgml）；Cs为苯甲酸或山梨酸标准品的含量（μgml）。F为稀释倍数；Axr