细胞生物学实验
利用MTT比色法测定细胞群体的相对细胞数量
f一、实验目的1熟悉掌握细胞传代培养2学习和掌握细胞生长速率的测定3学会用MTT法检测细胞的生长状况4了解MTT法在生物学研究中的应用
二、实验原理细胞生长曲线是观测细胞在一代生长期内增殖过程的重要指标，为培养细胞的细胞生物
学参数之一。
图一：体外培养细胞的一代生长曲线MTT全称为345dimethylthiahiazozy135diphe
ytetrazoliumromide，汉语化学名为34，5二甲基噻唑22，5二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formaza
）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490
m波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内OD值在07以内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。【注】MTT比色法的影响因素1溶剂溶解甲瓒能力不同；
f2培养基中的酚红、血清和PH变化可能影响OD值；3DMSO溶解能力强，但是可能与残留MTT发生反应，随着时间延长不断加深。（改良方案：
SDSDMSO）；
三、实验材料
1实验仪器：超净工作台，CO2培养箱，荧光显微镜2实验材料：HeLa细胞，96孔板3实验试剂：PBSPh74，MTT母液5mgmL溶于PBS，裂解液（10SDS001NHCL于
室温保存），胰酶，DMEM培养基，血清
四、实验步骤
1取生长期的HeLa细胞，用胰酶消化计数，配制细胞悬液浓度为8×104mL；2每列都加完全培养基100μL（除去第二列），取细胞悬液200μL接种到第二列，在第二列取100μL接种到第三列，依次类推；最终的细胞浓度见下表；3检测：弃去旧培养基，加入100μL含MTT的培养基（5mgmLMTT培养基110）；4孵育4hr，然后加100μL裂解液过夜；5用酶标仪测OD值，检测波长为570
m；
表一：96孔板设计（溶液为200μL）
1
2
3
4
5
6
A无细胞细胞原液2倍稀释4倍稀释8倍稀释16倍稀释
B无细胞细胞原液2倍稀释4倍稀释8倍稀释16倍稀释
C无细胞细胞原液2倍稀释4倍稀释8倍稀释16倍稀释
D无细胞细胞原液2倍稀释4倍稀释8倍稀释16倍稀释
E无细胞细胞原液2倍稀释4倍稀释8倍稀释16倍稀释
F无细胞细胞原液2倍稀释4倍稀释8倍稀释16倍稀释
G无细胞r