因此可以被相同的转录激活因子如上述的Gal4蛋白激活。通过这种双重或多重选择既提高了检测灵敏度又减少了假阳性现象。其他还有针对“诱饵”或“猎物”表达载体等所作的改进这里不一一详述。
在双杂交鉴定过程中要经过两次转化这个工作量是相当大的特别是寻找新的作用蛋白质的时候尤其如此。而且酵母细胞的转化效率比细菌要低约4个数量级。因此转化步骤就成为双杂交技术的瓶颈。Be
dixe
等人通过酵母接合型的引用避免了两次转化操作同时又提高了双杂交的效率。在酵母的有性生殖过程中涉及到两种配合类型：a接合型和α接合型这两种单倍体之间接合mati
g能形成二倍体但a接合型细胞之间或α接合型细胞之间不能接合形成二倍体。根据酵母有性生殖的这一特点他们将文库质粒转化α接合型酵母细胞“诱饵”表达载体转化a接合型细胞。然后分别铺筛选平板使细胞长成菌苔law
再将两种菌苔复印到同一个三重筛选平板上原则上只有诱饵和靶蛋白发生了相互作用的二倍体细胞才能在此平板上生长。单倍体细胞或虽然是二倍体细胞但DB融合蛋白和AD融合蛋白不相互作用的都被淘汰。长出来的克隆进一步通过β半乳糖苷酶活力进行鉴定。这项改进不仅简化了实验操作而且也提高了双杂交的筛选效率。
在研究蛋白质的结构功能特点、作用方式过程中有时还要通过突变、加抑制剂等手段破坏蛋白质间的相互作用。针对实际工作中的这种需要Vidal等人发展了所谓的逆双杂交系统reversetwohybridsystem。这项技术的关键是报道基因URA3的引入。URA3基因在这里起到了反选择的作用它编码的酶是尿嘧啶合成的关键酶。该酶能把5氟乳清酸5FOA转化成对细胞有毒的物质。Vidal等人通过改造在URA3基因的启动子内引入Gal4的结合位点。这个改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的选择性培养基上只有当“诱饵”和“猎物”相互作用激活URA3基因的表达才能生长。在含有5FOA的完全培养基上“诱饵”和“猎物”的相互作用则抑制细胞的生长。然而如果目的蛋白即与DB或AD融合的蛋白质发生了突变或者由于外加药物的干扰不再相互作用URA3基因不表达则细胞能在含有5FOA的完全培养基上生长。通过这种方法，Vidal等人筛选到了转录因子E2F1的突变物这些突变物仍然能结合视网膜母细胞瘤蛋白RB但是丧失了同另外一种称为DP1蛋白的结合能力。结果得到了体外结合实验的验证。通过对这些突变蛋白基因的测序他们发现了新的E2F1同DP1结合的位点。
f酵母双杂交系统（yeasttwohybridsystem）
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