，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。各种成分在工作液中的终浓度：
TrisHCl50mMpH74NP401去氧胆酸钠：025NaCl150mMEDTA1mMPMSF1mM抑蛋白酶肽，亮抑酶肽胃蛋白酶抑制剂各1956gmlNa3VO41mMNaF1mM
三、实验流程：
（1）转染后2448h可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30mi
细胞裂解液于
f4176C，最大转速离心30mi
后取上清；（2）取少量裂解液以备Wester
blot分析，剩余裂解液
加1956g相应的抗体加入到细胞裂解液，4176C缓慢摇晃孵育过夜；
（3）取10956lprotei
A琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3次，每次3000rpm离心3mi
；
（4）将预处理过的10956lprotei
A琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4176C缓慢摇晃孵育24h，使抗体与protei
A琼脂糖珠偶连；
（5）免疫沉淀反应后，在4176C以3000rpm速度离心3mi
，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15956l的2215SDS上样缓冲液，沸水煮5分钟；
（6）SDSPAGEWester
blotti
g或质谱仪分析。通过免疫共沉淀确定结合蛋白1．用磷酸盐缓冲液洗30块10cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。2．将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4℃以最大速度离心15mi
。3．收集上清（约30ml）并加入30956g的适当抗体，4℃摇动免疫沉淀物1h。4．加入09ml的蛋白质ASepharose悬液，4℃摇动免疫沉
f淀物30mi
。5．用含900mmolLNaCl的NETN洗蛋白ASepharose混合物，再重复洗5次。最后，用NETN洗一次。6．吸出混合物的液体部分。加入800956l的1215SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4mi
。7．将样品加入到大孔的不连续SDSPAGE梯度胶中，在10mA的恒定电流下电泳过夜。8．通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。9．从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml50乙腈洗两次，每次3mi
。10．用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。11．通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI477A或494A机器上进行自动Edma
降解测序。
四、注意的问题：
（1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Trito
X100。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（02％SDS，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。
f（2）使用明确的抗体，可r