内切酶均购于大连宝生物公司。
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12方法参照王家保等所述的方法5提取芒果DNA，用无菌的双蒸水溶解，采用核酸蛋白测定仪进行测定，20℃保存备用。采用天根总RNA提取试剂盒天根生化科技（北京）有限公司提取芒果总RNA，用RNasefree无菌水溶解，用大连宝生物公司的DNase试剂盒进行DNA去除，用10琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性和DNA是否去除干净，并用核酸蛋白测定仪对所得RNA的D260
mD230
m、D260
mD280
m及浓度进行测定，用TaKaRa公司的3′和5′RACE试剂盒进行目的基因的3′、5′转录。PCR反应程序为：94℃预变性4mi
；95℃变性50s，50℃复性50s，72℃延伸2mi
，30个循环；72℃延伸7mi
；反应体系为25μL，其中含10×PCRbuffer（含Mg2）25μL、25
gμLDNA模板20μL、20μmol引物各10μL、25UμLTaqDNA聚合酶04μL、50mmolLdNTPs20μL；反应体系在eppe
dorPCR仪上扩增，扩增反应结束后取10μL进行扩增产物的电泳，采用gelred染色后在紫外凝胶成像仪上观察、拍照分析。13UFGT基因全长cDNA和基因组DNA序列的获得以贵妃芒果的果实总RNA作为模板，采用SMARTerTMRACEcDNAAmplificatio
Kit（Clo
tech）反转录合成第一链cDNA，并参照该试剂盒的说明书进行cDNA3′端和5′末端cDNA的扩增。根据cDNA片段的测序结果，分别设计2条上游引物，以接头为锚定引物进行半巢式PCR反应。将3′端和5′末端的PCR反应产物用12琼脂糖凝胶电泳检测，确定所得到的片段大小是否与预测的片段大小一致。目的基因片段回收、连接、转化、鉴定及测序，并根据已知的片段和得到的cDNA3′端和5′末端的序列结果拼接该基因的全长cDNA。以上述cDNA和提取的基因组DNA为模板，设计特异引物，进行全长cDNA和基因组DNA序列扩增反应，PCR反应体系25μL，从中取6μLPCR产物加入02mLPCR管中，加入1μL6×Loadi
gBuffer，用10琼脂糖凝胶电泳检测扩增的片段大小是否正确。确定PCR产物中含有所需大小的目的片段一致后，对PCR产物进行普通琼脂糖凝胶电泳，用手术刀在紫外灯下切下含有目的片段胶块，再用DNA凝胶回收试剂盒（AgaroseGelDNAPurificatio
Kit，TaKaRa公司）进行目的片段回收，参照试剂盒说明书上的步骤进行回收。取5μL回收纯化后的目的DNA产物进行12琼脂糖电泳检测，以检验回收效果及大致含量，根据回收产物片段大小及其有效浓度，取适量回收纯化的产物与克隆载体pMD19T（TaKaRa公司）连接，目的DNA与克隆载体的摩尔比控制在3∶1左右。反应混合液包括1μLpMD19Tvectorr