高22,但要用到有毒
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流动相乙腈。另外,由于瑞利散射、拉曼散射的干扰,使荧光检测方法的条件构建和优化过程较为复杂,没有一定的专业基础较难完成。而紫外吸收法虽然灵敏度并不突出,但是可以用于植物体内多胺含量的测定,加上流动相中的甲醇毒性较低、仪器成本较低等优点,使得紫外吸收法成为当今国内用于测定植物多胺最常用的一种方法。
目前对于紫外吸收法检测波长的选择主要是苯甲酰氨基特征峰230
m处、苯基特征峰254
m处1516,18,23。以上2种选择对于多胺的检测虽然都有一定的根据,但是对于检测效果尚缺乏科学的比较。本研究应用高效液相色谱二极管阵列检测器(HPLCDAD)广谱记录光谱信息,同时针对棉花幼苗组织样本特点比较230、254
m2种检测波长的操作性、可靠性,最终优化建立了可应用于UV检测器的棉花幼苗组织样本中3种多胺的检测方法,并依据该方法比较棉花幼苗根、茎、叶组织内多胺含量的差异。
1材料与方法
11试验材料
供试棉花种子由廊坊师范学院生命科学学院遗传与育种研究所提供,为农大棉7号。
12试验方法
121棉花幼苗组织中多胺的提取取10~20g棉花3叶期幼苗的不同新鲜组织,液氮研磨后加入4mL预冷的5高氯酸溶液,冰浴浸提1h后离心(12000rmi
,30mi
,4℃);取上清液为样液,4℃保存备用。
122样品的苯甲酰化取500μL样液,加入10mL离心管中,先后加入14μL苯甲酰氯、1mL2molL氢氧化钠溶液,振荡混匀后于37℃水浴反应20mi
;加入2mL饱和氯化钠溶液,混匀后用2mL乙醚萃取,离心(1500rmi
,5℃,5mi
)后取1mL乙醚相真空干燥,用100μL甲醇溶解后,用022μm孔径有机相滤膜过滤,即可进样21。
123色谱条件的优化色谱仪:Agile
t1260I
fi
ity;色谱柱:JP3Agile
tZORBAXSBC18StableBo
dA
alytical46mm×150mm。
流动相与流速:综合华永有等方法22,24,以甲醇、水混合物为流动相,测试甲醇体积分数为50~90时不同流动相的色谱性能,每变化10进样测定1次,确定最佳流动相比例。通过比较流动相流速为05、06、07、08、09mLmi
的检测效果,确定最佳流速。
检测波长:以二极管阵列检测器收集190~900
m区间内的吸光度数据,重点比较多胺在230、254
m下标准曲线质量、回收率、标准偏差(RSD,)、峰型,再结合3种多胺的光谱信息确定适合的检测波长。
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柱温:30℃21。
时间:不限制。根据分析中杂质的具体洗脱情况,设定合理的分析时间。
124标准曲线的制作精确配制02r