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时传一次代(视生长情况)。ES细胞的换液1提前半小时左右将培养基从4℃冰箱取出,放于室温(或者放于37℃温箱内);2细胞培养皿从培养箱内取出,相差显微镜下作常规观察(判断生长情况,并确证未发生污染)后转入无菌操作台内;3将ES细胞培养皿内的液体吸出、弃去,换新鲜培养基(6cm培养皿约5mL,35cm培养皿约3mL培养基;若死细胞较多则可以先用PBS洗一次,再加培养基);4放回培养箱继续培养。ES细胞的传代1前一天下午做好所需数量的Feeder细胞板;2提前半小时左右将培养基从4℃冰箱取出,放于室温(或者放于37℃温箱内);3将ES细胞培养皿、Feeder细胞培养皿从培养箱内取出(相差显微镜下作常规观察,Feeder细胞应生长良好,细胞覆盖95左右,至少90以上的培养皿面积);ES细胞应生长良好,接近长满培养皿,细胞集落大小一致、疏密均匀,集落形状规则、呈椭圆形、边缘光滑、表面光滑,细胞生长致密、核大、胞质少;4将ES细胞培养皿内的液体吸出、弃去,用PBS1mL左右洗一遍,加入胰蛋白酶溶液,作用约30秒,小心吸出胰蛋白酶溶液,弃去;再作用15分钟,不时观察,待细胞层(皿底一层白色脏东西样膜)出现裂缝并明显开始下滑时,补加培养基,适度吹打(视消化程度及管口粗细而定,至看不到明显的大的细胞团块为止);平均分到Feeder培养皿中(滴加,以
f免将Feeder细胞吹脱落下来),滴加补加培养基至5ml左右(滴加,以免将Feeder细胞吹脱落下来;若为35cm培养皿,则补加至3ml左右),作好标签;5前后左右水平晃动培养皿,使ES细胞均匀分布于培养皿中,放入培养箱继续培养。ES细胞的冻存1常规方法将细胞消化成单细胞悬液;2转入试管,1000转分钟离心5分钟;3配适量冻存液(为含10二甲亚砜(DMSO),10FBS的DMEM培养液);4弃上清,每管加入1ml冻存液,吹打成细胞悬液(只要使ES细胞分散成35个细胞的小团块即可),转入冻存管,作好标签;5放入程序冻存盒内24小时后转入液氮罐中冻存。
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