ES细胞培养AFBS的灭活与分装1化冻将血清（FetalBovi
eSerum，Hyclo
e）从－20℃冰箱取出，放于4℃冰箱化冻过夜；也可室温（或浸于自来水中）化冻，化冻后若不马上灭活，可以放入4℃冰箱暂时保存；2灭活（1）放入室温的水浴锅内开始加热（同时放入一个内装200ml自来水的血清瓶，插入一根温度计，温度监控以此为准）；（2）当温度计显示56℃时，控制在此温度30分钟±3分钟；若不小心使温度上升超过56℃，则：若仍未超过60℃，且时间很短（比如：不超过5分钟），则仍可使用；若超过60℃，或者时间较长，则弃去不用，或者尝试用于ME细胞的培养；（2）取出，自然冷却至室温（约需1－3小时），可分装或－20℃继续冻存；3分装（1）转入细胞间，用移液器将血清分装，注意预先要将血清轻轻摇动数周、混匀；吹出血清时要注意：不要吹出气泡（血清很粘稠，很容易产生气泡；如果已产生气泡，则在酒精灯火焰上过一下）；标好批号和日期；（2）放入－20℃冰箱冻存分装一次大约可以使用12个月。B配制DMEM血清培养基1提前一天将分装好的FBS从20℃冰箱取出，放于4℃冰箱化冻；2在细胞间中将FBS以及其它需要添加的成分（如，丙酮酸钠、抗生素等），按照比例加入DMEM培养基中，作好标签；放入4℃冰箱保存。配制比例如下：50ml体积的干细胞培养液配制
DMEM（Highglucose）DMEM培养基（高糖
谷氨酰胺（）50ul
f非必需氨基酸500ul
丙酮酸钠500ul
B巯基乙醇？？
双抗50ul
血清75ml
LIF5ul
fC原代胚胎成纤维细胞（ME）的制备1取125135dpc孕鼠，断颈处死；2将鼠腹面向上放置，70酒精润湿、消毒腹部（防止腹毛飞扬，污染内脏及子宫），剪开皮肤层、肌肉层，打开腹腔，将连接在子宫上的结缔组织及脂肪剪去，将子宫取出，转入无菌10cm平皿中；3把平皿转入超净台；4用镊子打开子宫壁，挤出鼠胚，并与胚外组织、胎盘等分离，除去鼠胚的头、四肢及各种内脏（主要为肝脏、肺脏、心脏和肠胃等）；5将鼠胚移入另一新的无菌皿，用PBS洗三次；6弃去PBS，用弯头剪将鼠胚剪碎，加入PBS洗至溶液基本无色（1－4次）；7加入适量Trypsi
EDTA（025Gibco25520，下同），体积约等于组织块体积；8用滴管轻轻吹匀，室温下消化1－10分钟（或消化至溶液浑浊变粘），加入与消化液等体积培养基，轻轻吹打混匀（5－10次），静置；9沉降后将上部溶液轻轻吸出，转入离心管中。10将细胞悬液管离心（1000转5分钟）；11弃去上清，向沉淀中加入适量培养基，轻轻吹打r