种至10cm细胞培养皿，补加适量培养基，作标签（ME－0；注意：若冻存，则可以使用复苏后的0代ME制作Feeder；若直接使用则最好不用0代ME细胞做Feeder，要传到一代以后再用来制作Feeder比较好），转入培养箱培养；12视细胞生长情况换液（一般3天换液一次），若细胞已长满，则冻存，或者1：35传代（视细胞疏密而定），放入培养箱继续培养（此后不用再换液）；1－5代的ME细胞均可用来制作Feeder。
f饲养层细胞（Feeder）的制备注：含10ugml丝裂霉素C的DMEM血清培养基（FBS占10）（实验室所用MMC为10mgmL，Calbiochem）1弃去细胞培养皿中的培养液，加入适量含10ugml丝裂霉素C的培养基（DMEM10FBS）；2放入培养箱培养3小时（2－4小时）；3用01明胶处理培养皿（将明胶加入，摇动使明胶覆盖全部皿底，然后吸出明胶弃去即可），室温放置2小时以上，至皿底明胶干燥为止；4弃去含有丝裂霉素C的培养基，加入2－3mLPBS，轻轻摇动，弃去PBS，如此洗35次（必须洗3次以上，以便彻底洗去残存的丝裂霉素，丝裂霉素是有丝分裂抑制剂，因而对ES细胞有毒性）；24加入适量胰酶消化30秒，吸去消化液，静置至细胞层出现裂缝或明显滑壁为止，加入培养基，吹打，种至明胶处理过的培养皿中即可（如细胞过稀，可再补加丝裂霉素处理过的细胞），半小时后即可使用（如果急用，则可以用ES细胞培养基终止消化，然后与ES细胞一起转入明胶处理过的新板上），可使用6－10天，用前更换培养液（如未用明胶处理培养皿，则需在培养箱中放置2小时以上方可使用；最好是前一天下午制作Feeder，第二天上午使用，这时的Feeder状态最好，最适于ES细胞贴壁生长，而且万一制作的Feeder在第二天早上发现出了问题，还可以赶紧补做）。
ES细胞培养基DMEM15S2巯基乙醇：55uML谷氨酰胺：2mMLIF：1000UmL货号ESG1107非必需氨基酸：100uM双抗：1000XGibco21985023SigmaG8540Chemico
ESGROLIF10E7u
its，
100X10000X
100X100X
Gibco11140050
Gibco15070063
fES细胞的复苏1提前制备好相应数量的Feeder；2准备37－39℃的热水，从液氮罐中取出所需冻存管（冻存细胞），迅速投入热水中，迅速剧烈摇动直至冻存液全部融化；3转入无菌间，1000转分钟离心510分钟；4弃上清，加入1mlES培养液轻轻吹打重悬，转入铺有饲养层细胞的培养皿中（冻存前细胞来自多大的培养皿，复苏时就用相应大小的培养皿），补加适量培养液；5转入培养箱培养，次日换液；此后每24小时换一次液，每48小时传一次代（视生长情况r