引物设计软件Primer50的操作（以小鼠GAPDH为例）：1、在NCBI上搜索该基因，选择Nucleotide，输入MUSSGAPDH。
2、找到该基因，点击打开基因信息。
3、点击进入CDS选项。
f4、找到编码区所在位置。在origi
中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。
5、打开PrimerPremier50软件，FileNewDNASeque
ce，将复制的序列拷贝进弹出的窗口1NewSeque
ce中。
f6、点击窗口中Primer，弹出窗口2Primerpremier。
7、点击窗口2中Search，出现窗口3SearchCriteria，按照图中设置各参数。一般PCRProductSize可以在80300范围设置。Primerle
gth为20加减2bp。
f8、在SearchMode中选中Ma
ual，点击SearchParameters，弹出窗口4Ma
ualSearchParameters。修改默认值中的TM为5961，GC为4060，点OK。
f9、直接再点击弹出窗口5SearchProgress中的OK。
f10、软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，自动跳出结果窗口6SearchResult，搜索结果默认按照评分（Rati
g）排序，分值偏高的比较好。另外还有产物长度，Tm值等信息。
f11、点击窗口6中的任何一个搜索结果，可以在PrimerPremier引物窗口中会出现该对引物的详细综合信息，包括上游引物和下游引物的序列和位置等。比如2号引物的PCR产物在220至656之间，点击S出现正向引物的信息，点A出现反向引物的信息，图中显示的是反向引物A
tiSe
se的信息。对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’端不要以A结尾，最好是G或者C，T也可以；3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配；此窗口中需要着重查看的包括：Tm应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“No
e”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，分值再高出现错配不能用，其他二级结构可以适当放宽，根据情况决定。
f12、点击EditPrimer会出现窗口7，在该窗口中可以选中引物序列并拷贝出来。
13、严格来说引物确定后，还需要对于上游和下游引物分别进行Blast分析，一般来说，多少都会找到一些其他基因的同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析，只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。
14、引物r