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反义平均数,再上下波动度(±4℃,或±5℃)4、引物各合成5OD,每OD一瓶分装好5、引物稀释:加DEPC水量为(μl)
molOD×管上所标OD数×100是为10pmolμl浓度的引物溶液八、PCR产物电泳先将110μl左右PCR产物,加已点在纸上的溴酸兰,反复吸打混匀后进行电泳,一般电流为10mA,电源100V,电泳30分钟,紫外灯下观察,满意的结果扫描打印。九、几个注意点:
f1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴?2、Rt时,先打开PCR预热30分钟。3、RNA抽提前,打开离心机预冷。TRIzol法抽提总RNA细胞1×107组织100mg↓加1mlTRIzol细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块↓匀浆(要彻底,后转至EP管)(组织匀浆量100mg时分装1ml每EP管)↓颠倒混匀10下,室温5分钟↓加氯仿15体积(02ml)(必须按总体积的15)↓颠倒混匀10下,室温5分钟↓4℃,离心12000g,15分钟↓转上层水相(约400μl)于另一15mlEP管中↓加等体积异丙醇(约400μl),混匀室温10分钟↓4℃,离心12000g,10分钟↓弃上清
↓加冰预冷的75乙醇(用DEPC水配)1ml↓4℃离心7500g,5分钟↓弃上清,空气干燥510分钟(不能完全干燥)↓溶于DEPC水中至20μl(10μl20μl)(可在5560℃水中,10分钟助溶)注:1、RNA若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中,否则DEPC溶解2、细胞组织加TRIzol匀浆后,可在60℃放置至少一个月(甚至可一年以上)3、RNA在75乙醇中,28℃至少可保存一周,20℃至少可保存一年
两步法RTPCR(第一步:逆转录反应)
f试剂浓度体积终浓度
RNA23μl115μlOligodT15005μgμl4μl2μl0005μgμl(稀释10倍后用)↓混匀,离心,70℃5mi
↓立即冰水浴,稍离心
↓试剂浓度体积终浓度
MMLVBuffer5×8μl4μl1×dNTP10mM2μl1μl05mMRNasi
40Uμl1μl05μl20μMMLV200Uμl2μl1μl200U总体积40μl(20μl)↓混匀,离心,42℃60mi
↓95℃10mi
(破坏MLV)↓4℃保存两步法RTPCR(第二步:PCR反应)总体积20μl50μl试剂浓度体积终浓度
TaqBuffer10×2μl5μl_1×MgCl225mM12μl3μl15mMdNTP10mM02μl05μl200uM上游引物10pmolμl03μl1μl10pmol下游引物10pmolμl03μl1μl10pmolcDNA模板X110μlDEPC水20μl43μlXTaq酶25Uμl03μl1μl25Uμl↓混匀
↓97℃,5分钟↓立即冰水浴
↓混匀
↓95℃5分预变性94℃30秒变性
fX℃40秒退火72℃30秒延伸72℃7分终末延伸2836循环,4℃保温三、电泳:加110μlPCR产物溴芬兰(125μl)混匀,加样,电泳。注意:Taq酶、MMLV、R
asi
等20℃保存,操r
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