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其他溶剂提取色素时,计算公式也有所不同。叶绿素a、b在95%乙醇中最大吸收峰的波长分别为665
m和649
m,类胡萝卜素为470
m,可据此列出以下关系式:Ca1395D665688D649(1711)Cb2496D649732D665(1712)Cx(1000D470205Ca114Cb)245(1713)二、实验材料、试剂与仪器设备
f(一)实验材料新鲜植物叶片(或其他绿色组织)。(二)试剂95%乙醇(或80%丙酮)。石英砂。碳酸钙粉。(三)仪器设备分光光度计,研钵1套,剪刀1把,玻棒,25mL棕色容量瓶3个,小漏斗3个,直径7cm定量滤纸,吸水纸,擦镜纸,滴管,电子天平(001g感量)。三、实验步骤1取新鲜植物叶片,擦净组织表面污物,剪碎(去掉中脉),混匀。2称取剪碎的新鲜样品03g,共3份,分别放入研钵中,加入少量石英砂和碳酸钙粉及2~3mL95乙醇(或80丙酮)研成匀浆,再加乙醇10mL,继续研磨至组织变白,静止3~5mi
。3取滤纸1张,置漏斗中,用乙醇湿润,沿玻璃棒把提取液倒入漏斗中,过滤到25mL棕色容量瓶中,用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次,最后连同残渣一起倒入漏斗中。4用滴管吸取乙醇,将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25mL,摇匀。5把叶绿体色素提取液倒入比色杯内。以95%乙醇为空白,在波长665、649和470
m下测定消光度。6按公式1711、1712、1713(如用80%丙酮,则按公式178、179、1710)分别计算叶绿素a、b和类胡萝卜素的浓度(mgL),1711、1712式相加即得叶绿素总浓度。
f四、结果计算求得色素的浓度后再按下式计算组织中各色素的含量(用每克鲜重或干重所含叶绿体色素的毫克数表示):
(mgg)注意事项1为了避免叶绿素的光分解,操作时应在弱光下进行,研磨时间应尽量短些。2叶绿体色素提取液不能浑浊。可在710或750
m波长下测量消光度,其值应小于当波长为叶绿素a吸收峰时消光度值的5%,否则应重新过滤。3用分光光度计法测定叶绿素含量,对分光光度计的波长精确度要求较高。如果波长与原吸收峰波长相差l
m,则叶绿素a的测定误差为2%,叶绿素b为19%,使用前必须对分光光度计的波长进行校正。校正方法除按仪器说明书外,还应以纯的叶绿素a和b来校正。4在使用低档型号分光光度计(如:72、125、721型等)测定叶绿素a、b含量时,因仪器的狭缝较宽,分光性能差,单色光的纯度低(r
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