，漂洗贴壁细胞一次后倒掉。（可以省略）3消化：每瓶加入1mL消化液（025胰蛋白酶或0025EDTA混合液11），轻轻摇动培养瓶，经消化液铺满所有细胞表面，在倒置显微镜下待12细胞变园后加适量完全培养液终止。或细胞层略有松动，肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉消化液，再继续作用2～3分钟，轻轻摇动，细胞层可随残留的消化液呈片状从瓶壁上脱落下来，在显微镜下可发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时应立即终止消化）。在37°或25°以上环境进行消化。
4终止：加入完全培养基适量（通常1020胎牛血清培养基）5ml，用吸管反复吹打瓶壁上的细胞，吹打时要按顺序进行，以确保所有瓶壁均吹打到，吹打时动作要轻柔，不要用力过大，尽可能不要出现泡沫，以避免细胞的机械损伤。
f5离心：离心（1100rpm）沉淀细胞（510分钟），去除培养基（含胰酶及EDTA）。6计数：离心前先滴好计数板待计数，计算细胞的浓度。7传代或冻存：离心后用完全培养基调整适当的细胞浓度后再分瓶培养（可13至15传代，在25cm2的培养瓶中长满细胞可达5106ml，经10倍稀释每瓶达105ml即可，25cm2的培养瓶每瓶5ml培养液）。或用冻存液调整浓度（一般达1107）冻存。（到此步时经证实未被细菌或真菌污染，则撤去抗生素，以免对细胞的生长长生不利影响，指原代培养细胞）四．细胞冻存：细胞冻存液：20小牛血清10二甲基亚砜DMSO70培养液或，10二甲基亚砜DMSO90小牛血清操作步骤：选对数增生期细胞（证明无支原体污染），在冻存前一天换液。按常规方法把培养细胞制成悬液，计数，使细胞密度达5107ml左右，离心，去上清液。（冻存细胞数量要充分，密度达5107ml，在溶后稀释20倍时，仍能保持5105ml数量）。一般25cm2的培养瓶满瓶才达到105加入配置好的冻存液，与去上清液相同的量一滴一滴的加入离心管中，然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。冻存细胞时培养液中加入保护剂10二甲亚砜DMSO或甘油，可使冰点降低，使细胞内水份在冻结前透出细胞外。（细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含510DMSO和9095原来的细胞生长用之新鲜培养基均匀混合。注意由于DMSO稀释时会释放出大量热能，故不可将DMSO直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成）分装于无菌冻存管中，每管15ml悬液。旋好冻存管并仔细检查，一定要盖紧，做好标志。冻存：冰箱4℃放2小时，75℃过夜，转液氮保存，4°，0°，20°各30分钟（现代分子生物学实验技术P647），最后直接放入液r