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生物化学实验报告
动物营养研究所张树润
20151012猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活性测定一．实验目地1通过实验了解活性物质的分离提取。2了解超氧化物歧化酶的基本功能与应用。二．实验原理超氧化物歧化酶是一种酸性蛋白，是唯一以自由基为底物的酶，具有清除自由基的功能酶，在酶分子上共价连接金属辅基，因此它对热、PH、以及某些理化性质表现出异常的稳定性。该酶首次从牛红细胞中分离得到，是一种蓝色含铜蛋白，之后，研究发现该蛋白酶具有催化氧发生歧化反应的能力，因此将其命名为超氧化物歧化酶12。超氧化物歧化酶是一种能专一地清除超氧离子自由基（O2）的金属酶，它具有抗衰老、抗辐射、抗炎抗癌等作用，因而在医药（如关节炎、红斑狼疮等疾病的治疗3）、化妆品有防晒抗炎效果4、食品工业（SOD灵芝菌5等）等方面具有了广泛的应用前景。
超氧化物歧化酶是广泛存在于生物体内的一种金属酶可催化超氧阴离子自由基O2与H发生歧化反应生成H2O2和O2。SOD催化下述反应：2H2O2→H2O2O2。
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超氧化物歧化酶按照它所含金属离子的不同，可分为CuZ
SOD、M
SOD、FeSOD等三种。CuZ
SOD为二聚体，呈蓝绿色；M
SOD呈紫红色；FeSOD呈黄褐色。
SOD提取、纯化制备方法各异常用方法有经典的溶剂沉淀法、盐析法、超滤法和层析法等67。本实验采用有机溶剂沉淀法8以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行纯化。酶活力测定可用以下方法：邻苯三酚自氧化法9、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸法等。
该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50的酶量定义为一个酶单位。
样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G250法测定。考马斯亮蓝G250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一定范围内，溶液在595
m波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定，测定范围11000μg。三．实验试剂与器材
1实验试剂ACD抗凝剂、09Nacl、丙酮、95乙醇、氯仿、考马斯
亮蓝G250、50mmolLpH83磷酸缓冲液、10mmolLEDTA钠盐溶液、3mmolL邻苯三酚溶液等
2实验器材
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紫外光分光光度计、可见光分光光度计、分析天平、具塞试管、刻度吸管、离心机、烧杯、移液枪、试管架、EP管等。四．实验方法1SOD的提取1取新鲜猪血20ml于50ml离心管，4000rmi
，10mi
离心，去上层血浆，取下层红血球粘稠液量其体积，然后加入2倍体积的09NaCl溶液清洗r