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强。总之实验是喜欢强阳性,不喜欢假阴性,呵呵。任何实验都需要花时间摸索才能找到其最佳的工作条件。
另附免疫组化常见问题解析。原理是相同的,只是最后的显色方法不一样,有些问题有启发作用。
免疫组织化学
1边缘效应原因1)组织边缘与玻片粘贴不牢,边缘组织松脱漂浮在液体中,每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致解决办法:制备优质的胶片(APES或多聚赖氨酸),切出尽量薄的组织切片,不厚于4微米,组织的前期处理应规范,尽量避免选用坏死较多的组织。
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f2)切片上滴加的试剂未充分覆盖组织,边缘的试剂容易首先变干,浓度较中心组织高而致染色深。解决办法:试剂要充分覆盖组织,应超出组织边缘2mm。用组化笔画圈时,为了避免油剂的影响,画圈应距组织边缘34mm。
2产生组织切片非特异性染色的原因有哪些?如何解决?1抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。解决办法这可通过缩短一抗二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。
2一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色,建议试用单克隆抗体看看。3内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高(含血细胞多的组织),需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色;
4非特异性组分与抗体结合,这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果;
5DAB孵育时间过长或浓度过高;6PBS冲洗不充分,残留抗体结果增强着色,在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要;
7标本染色过程中经常出现干片,这容易增强非特异性着色。3免疫组化染色呈阴性结果的原因有哪些?后进行统计分析即可。
3评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度(03分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色)、阳性范围进行评分(14分为025、2650、5175、76100),最终可以分数相加,再进行比较。对于以上这几种方法,各有利弊,请细心选择。要想得到正确结果的前提是你要做出着色均匀、背景很浅的高质量切片。
12DAB呈色后到底什么样染色是特异性染色?
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f阳性标记可以从色度特征,阳性标记细胞学特征来进行基本的判断。色度特征:一般而言,抗原含量越多,分布密度越高,标记方法越敏感,阳性结果显色则越强。根据阳性标记的显色程度分为:淡黄色,提示为弱抗原;棕黄色,提示为中等度抗原;棕黑色,示为强抗原。在结果判断中,后两者较有意义,可作为判断依据。细胞学特征:阳性表达必须在细胞特定的抗原部位,若不在抗原所在部位的r
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