3．连接真空泵和真空转移仪，剪取一块适当大小的膜（膜的四边缘应大于塑胶屏孔口的5mm），膜在Tra
sferbuffer浸湿5分钟后，放置在多孔渗水屏的适当位置。
f4．盖上塑胶屏，盖上外框，扣上锁。
5．将胶的多余部分切除，切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔，并至少盖过边缘
约2mm，以防止漏气。
6．将胶小心放置在膜的上面，膜与胶之间不能有气泡。
7．打开真空泵，使压强维持在5058mbar；立即将tra
sferbuffer加到胶面和
四周。每隔10mi
在胶面加上1mltra
sferbuffer，真空转移2小时。
8．转膜后，用镊子夹住膜，于1xMOPSGelRu
i
gbuffer中轻轻泡洗10秒，
去除残余的胶和盐。
9．用吸水纸吸取膜上多余的液体后，将膜置于UV交联仪中自动交联。
10．将胶和紫外交联后的膜，在紫外灯下检测转移效率。避免太长的紫外曝光
时间
12．将膜在20℃保存。
7探针的制备
1．在15ml离心管中配制以下反应液：模板DNA25
g
1ul
Ra
domPrimer2ul灭菌水11ul总体积：14ul
2．95°C加热3分钟后，迅速放置于冰冷却5mi
。
3．在离心管中按下列顺序加入以下溶液：
10×Buffer25ul
dNTPMixture25ul
111TBqmmola32PdCTP5ul
ExofreeKle
owFragme
t1ul
4．混匀后（25ul），37°C下反应30分钟。短暂离心，收集溶液到管底。
5．65°C加热5mi
使酶失活。
8探针的纯化及比活性测定：
1．准备凝胶：将1g凝胶加入30ml的DEPC水中，浸泡过夜。用DEPC水洗涤膨胀
的凝胶数次，以除去可溶解的葡聚糖。
2．取1ml一次性注射器，去除内芯推，将注射器底部用硅化的玻璃纤维塞住，
在注射器中装填SephadexG50凝胶。
3．将注射器放入一支15ml离心管中，注射器把手架在离心管口上。1600g离心4
f分钟，凝胶压紧后，补加SephadexG50凝胶悬液，重复此步直至凝胶柱高度达注射器09ml刻度处4．100ulSTE缓冲液洗柱，1600g离心4mi
。重复3次。5．倒掉离心管中的溶液后，将一去盖的15ml离心管置于管中，再将装填了SephadexG50凝胶的注射器插入离心管中，注射器口对准15ml离心管。6．将标记的DNA样品加入25ulSTE，取出05ul点样于DE8paper上，其余上样于层析柱上。7．1600g离心4mi
，DNA将流出被收集在去盖的离心管中，而未掺入DNA的dNTP则保留在层析柱中。取05ul己纯化的探针点样于DE8paper8．测比活性。
9．预杂交：1．将预杂交液在杂交炉中68℃预热，并漩涡使未溶解的物质溶解。2．加入适当的ULRAhyb到杂交管中以100cm2膜面积加入10mlULRAhyb杂交液，42℃预杂交4hr。
10．探针变性：1．用10mMEDTA将探针稀释10倍。2．90℃热处理稀释后探针10mi
后，立即放置于冰上5mi
。3．短r