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RTPCR常见问题与分析
作者：来源：日期：20071025本站论坛
在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RTPCR产物？参考见解：1、RNA被降解：在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA；使用良好的无污染技术分离RNA；在将组织从动物体取出后立刻处理；在100％甲酰胺中储存RNA如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过80，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥08mMDTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT；2、RNA中包含逆转录抑制剂：过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（vv）乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元（025μg到04μgμl）以帮助小量样品RNA的恢复；逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐；将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂；3、多糖同RNA共沉淀：使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖；4、用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火：确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟；对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligodT或随机六聚体确定GSP是反义序列；5、起始RNA量不够：增加RNA量；对于＜50
g的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用01μg到05μg乙酰BSA；6、RNA模板二级结构太多：将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性退火；提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃，对ThermoScript可以到65℃。注意：不要在＞60℃时使用oligodT引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP；对于＞1kb的RTPCR产物，保持反应温度≤65℃。注意：不要在高于37℃时使用MMLV；如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物；7、引物或模板对残余的RNA模板敏感：在PCR前用RNaseH处理。8、靶序列在分析的组织中不表达：尝试其他靶序列或组织。9、PCR没有起作用：对两步法RTPCR，不要在PCR步骤中使用超过15的逆转录反应产物；10、PCR引物设计较差：避免在引物3端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。最佳引物浓度介于01μM到05μM之间。为了精确确定引物浓度，在260
m测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。11、富含GC的模板：于GC含量＞50％的模板，使用PCRxE
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。12、镁离子浓度太低：从1mM到3mM，间隔05mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意：对实时定量PCR，使用3mM到5mM的镁离子浓度。13、退火温度太高：使r