生物化学实验二：DNA的琼脂糖凝胶电泳
指导教师：李玉芹一、目的通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。二、原理琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（ethidum
bromideEB），在紫外光下
可以检出10
g的DNA条带，在电场中，pH80条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。琼脂糖凝胶有如下特点：1DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值
成反比，分子越大迁移得越慢。2琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子其迁移速度在不同浓度
的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率u的对数与凝胶浓度t成线性关系。3电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随
着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5vcm。4电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响
不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于05的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。5嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入
到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA使其刚性更强还会使线状迁移率降低15。6离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没
有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离
f子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。对于天然的双链，常用的几种电泳缓冲液有TAE、TBE等，一般配制成浓缩母液，室温保存，用时稀释。三、主要仪器1恒温培养箱3微波炉四、试剂1三羟甲基氨基甲烷（Tris）3乙二胺四乙酸EDTA5蔗糖7溴化乙锭9DNA样品五、实验步骤1缓冲液的配制①5×TBE5倍体积的TBE贮存液配1000ml5×TBETris硼酸05mollEDTAPh80②凝胶加样缓冲液6×溴酚蓝蔗糖③溴化乙锭溶液EB2制备琼脂糖凝胶按照被分离DNA的大小决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：琼脂r