,并且不损害它的活性。
间隔臂:目标蛋白质的结合位点位于分子中较深的部位,如果将配基直接偶联到基质上,受到空间位阻的影响,配基不能到达目标蛋白的结合位点,因此与目标蛋白的结合能力低。于是在配基与基质之间插入一个间隔臂可以使结合更加容易。间隔臂使结合最大化的同时要避免非特异性结合。间隔臂的长度是关键,太短,无效太长,发生非特异性结合。一般规则:偶联的分子量小于1000时使用间隔臂;当大分子量,则不一定要。
二硫键:蛋白质的的二硫键在半胱氨酸残基的硫醇之间形成,包内蛋白离开细胞后,二硫键常以氧化状态存在。此键在蛋白质分子的立体结构形成上起着一定的重要作用。为了确定蛋白质的一级结构,首先必须将二硫键打开,使成为线状多肽链。
上样方式:(1)直接上样(2)间接上样
洗脱方式:(1)pH值洗脱:pH的改变可以改变带电荷的配基基团和结合蛋白的离子化程度,使它们结合位点的亲和性降低。(降低pH的方法)(2离子强度洗脱:
3竞争性洗脱:(咪唑)
再生:1先用强变性剂6M盐酸胍冲洗柱子2用水冲洗干净302SDS冲洗柱子4用水冲洗干净550乙醇冲洗柱子6用水冲洗干净7用100mMEDTA50mMTris100mMEDTA8用水冲洗干净9用100mM硫酸镍孵育柱子1020乙醇中4℃保存
PH80冲洗柱子
上清缓冲液及配方
3
f上清纯化缓冲液
配方
LysisBuffer
50mMTrisHCl;150mMNaCl;20mMImidazole;pH80;
Elutio
Buffer150mMTrisHCl;150mMNaCl;50mMImidazole;pH80;
Elutio
Buffer250mMTrisHCl;150mMNaCl;100mMImidazole;pH80;
Elutio
Buffer350mMTrisHCl;150mMNaCl;300mMImidazole;pH80;
包涵体缓冲液及配方
包涵体纯化缓冲液IBLysisBuffer1
IBLysisBuffer2
配方20mMTris;150mMNaCl;2mMEDTA;2mMDTT;
1Trito
X100;PH80;50mMTrisHCl;150mMNaCl;8Murea;pH80;
IBElutio
Buffer150mMTrisHCl;150mMNaCl;20mMImidazola;8Murea;pH80;
IBElutio
Buffer250mMTrisHCl;150mMNaCl;50mMImidazola;8Murea;pH80;
IBElutio
Buffer350mMTrisHCl;150mMNaCl;100mMImidazola;8Murea;pH80;
IBElutio
Buffer450mMTrisHCl;150mMNaCl;300mMImidazola;8Murea;pH80;
IBElutio
Buffer550mMTrisHCl;150mMNaCl;500mMImidazola;8Murea;pH80;
4
f试剂及作用
1Trito
X100曲拉通:具亲水端和疏水端,可将膜蛋白从细胞膜上解离下来,达到提取膜蛋白的作用。常用的非离子性去垢剂。用量:13Trito
X100。
2TCEP(三2羧乙基膦):是一种非常有效的硫醇类还原剂,广泛用作蛋白质化学及蛋白质组学研究中二硫键的定量还原剂。该试剂在水溶液中的稳定性和溶解性都很好。r