氨基酸的鉴定(纸层析法)
实验目的:1、掌握纸层析法的基本原理2、通过对氨基酸的分离,掌握纸层析的操作方法并学会分析未知样品中的氨基酸组分。实验原理:1、层析法又称色谱法Chromatography,是一种物理的分离方法。利用混合物中各组分物理化学性质的差异如吸附办、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等,使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中,并使各组分以不同速度移动,从而得到有效的分离。操作方式纸层析、薄层层析、柱层析等。分离机理分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析等。2、纸层析法是用滤纸作为情性支持物的分配层析法,展层溶剂由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上的羟基具有亲水性,在滤纸上水就被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。当有机溶剂流动相沿纸流动经过层析点时,层析点上溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。由于溶质中各组分的分配系数不同,移动速率也不同,因而可以彼此分开。
物质被分离后在纸层析图谱上的移动速率用Rf值来表示:
3、在一定条件下,物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。4、本实验利用纸层析法分离氨基酸,利用茚三酮反应将氨基酸层析点显色来鉴定氨基酸的种类。试剂:1、酸性展层剂正丁醇:88甲酸水1532VV2、显色储备液:04molL茚三酮异丙醇甲酸水2015VV3、标准氨基酸溶液6mgml苯丙氨酸Phe、甘氨酸Gly、脯氨酸Pro、组氨酸His4、未知样品液:上述4种氨基酸中的一种或几种混合液每组任选一个样品实验器材:1、滤纸2、烧杯3、剪刀4、毛细管5、层析缸6、微量注射器
f7、电吹风8、保鲜膜操作方法:一、点样1、量取30ml层析溶剂、1ml显色贮备液于层析缸中,混匀密闭,静置。(展层缸洗净后应除去多余的水,否则会影响展层溶剂的比例而影响展层)2、戴好手套,在桌上铺好一层保鲜膜。取一张干净滤纸,将其剪裁为18cm×14cm。在纸的一端距边缘2cm处用铅笔轻轻划一条直线,在此直线上等距离分出几个点作为点样原点。(点样操作时应戴手套,防止样品及滤纸受污染)3、用毛细管将标准氨基酸及未知样品分别点在点样点上,每次点样后用电吹风冷风吹干再点下一次,点样点直径不超过5mm。
二、层析与显色1、将滤纸卷成圆柱形,用针线缝合或钉书针固定成圆筒状,纸的两边不能接触。
2、将滤纸竖直放入盛有展层剂的层析缸中,迅速盖紧层析缸盖点样点的一端在下,展层剂液面需低于r