实验一还原糖和总糖的测定35二硝基水杨酸比色法
一、实验目的
掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
二、实验原理
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，35二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3氨基5硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540
m波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以09。
三、实验材料、主要仪器和试剂
1．实验材料小麦面粉；广范pH试纸。
2．主要仪器（1）大试管：2×20cm×14（2）烧杯：100mL×3（3）三角瓶：100mL×1（4）容量瓶：100mL×3（5）移液管：1mL×3；2mL×2；10mL×4（6）吸耳球、玻璃棒（7）恒温水浴锅（8）漏斗、滤纸（9）白瓷缸、电炉（10）精度天平
f（11）分光光度计3．试剂（已制备）
（1）1mgmL葡萄糖标准液准确称取90℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到
100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。（2）35二硝基水杨酸（DNS）试剂将63g35二硝基水杨酸（DNS）和2molLNaOH溶液262mL，加到500mL含有185g酒石酸
钾钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中，710天后才能使用。
（3）6molLHCl和6molLNaOH。
四、操作步骤
1．制作葡萄糖标准曲线取7支2×20cm大试管编号，按表1分别加入浓度为1mgmL的葡萄糖标准液、蒸馏水和35
二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。
表1葡萄糖标准曲线制作
管号
葡萄糖含量（mg）
1mgmL葡萄糖标准液蒸馏水
（mL）
（mL）
DNS（mL）
吸光度值（A540）
0
0
0
2
15
1
02
02
18
15
2
04
04
16
15
3
06
06
14
15
4
08
08
12
15
5
10
10
10
15
6
12
12
08
15
将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5mi
，取出，用流动水冷却至室温r