酸氢二钾2克，四水硫酸锰025克，七水硫酸镁058克，蒸馏水1升。固体培养基琼脂200克进口的15克，蒸馏水定容至10升；半固体MRS培养基，加09琼脂和1的氯化钙。再生培养基：不含吐温80的液体MRS，明胶25，氯化镁25mmolL氯化钙25mmolL，蔗糖05molL，小牛血清05。选择培养基：在液体MRS基础上调节pH1、pH2、pH3添加牛胆盐1、2、3。LBP缓冲液：TrisHCl10mmolL氯化钙20mmolL，蔗糖05molLpH6340％聚乙二醇PEG6000溶液用灭菌高渗缓冲液配制，溶菌酶储液用TE配置。323实验设备与仪器高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，生化培养箱，紫外可见分光光度计、电子天平33实验步骤
f331原生质体制备3311菌种活化
将实验室所保存的来自酸奶和牛场的具有一定的耐受胆盐和耐受酸度的乳酸菌，转接于MRS培养基中37℃中过夜培养，进行菌株活化（图1）。
A
B
C
D
E
F
图1MRS液体培养基，37℃过夜培养10～12h，进行菌株活化
3312菌株前处理每几株菌过夜培养后新鲜菌液按2一起接种于5ml分别含10甘氨酸、1mgml青霉
素、05甘氨酸05mgml青霉素MRS液体培养基37℃振荡培养4h（图2）。
ABC
DEF
ABC
DEF
ABC
DEF
12GlyMRS
10ugml青霉素MRS06Gly05ugml青霉素图237℃培养4h至对数期前期
3313制备原生质体悬液取1ml混合培养菌液，离心收集菌体，高渗缓冲液洗涤2次，重悬于高渗缓冲液中，
甘氨酸和青霉素预处理的菌体分别添加终浓度为2mgml溶菌酶，37℃保温10～20h，显微镜下观察破壁情况。酶解后当90％以上菌体破壁时，3000rmi
离心10mi
，再用高渗
f缓冲液洗涤2次，重悬于50ul高渗缓冲液中备用。酶解条件如表1。
表1各预处理下菌株酶解条件
预处理条件
预处理
酶解
原生质体形成率
12Gly
4h
2h
10ugml青霉素
4h
1h
12Gly05ugml青霉素
4h
1h
332原生质体灭活
灭活的双亲原生质体只有通过融合后致死损伤得到互补才能形成融合子，因此采用能
引起细胞不同部位的致死作用的热和紫外线灭活方法，热灭活的致死机理是细胞质中蛋白
变性，紫外线灭活的机理是核酸DNA断裂所致。利用原生质体互补致死灭活作为分子标
记。两亲株融合后，损伤可以互补，形成能够生长繁殖的融合子。基因组改组技术应用多
母本递进融合，定向筛选具有重要表型特征改变的突变体。作为有效的工业微生物菌种改
造技术，可以用于工业微生物复杂表型的改良1011。
取悬于缓冲溶液中的12原生质体液60℃保温120mi
，其余12紫外线下照射32mi
，
分别灭活。原生质体灭活条件如表2。
表2原生质体灭活条r