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外光的性质,吸收峰在280
m处,其吸光度即光密度值与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238
m的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。低浓度的盐,例如生化制备中常用的(NH4)2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测,因为此时只需测定蛋白质浓度的变化,而不需知道其绝对值。此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质,有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表,再进行计算的方法,加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差。紫外吸收法测定蛋白质的实验案例:材料:uv-1100型可见一紫外分光光度计、1cm石英比色皿;5.00mgML的标准蛋白质溶液、0.9%氯化钠溶液、待测蛋白质溶液。方法:1绘制吸收曲线以0.9%NaCI溶液为参比渡,将浓度为0.3mg/mL的蛋白质溶液,进行披长扫描测量,得到吸收曲线
f从吸收曲线可得0.3mgmL标准蛋白质溶液的最大吸收波长为279m,此波长下的吸光度为0.167。2绘制标准曲线:取六只试管,编号后按表1依次加入标准蛋白质溶液和09%氯化钠溶液,以0管空白,在279
m下测定各管中溶液的吸光度值并绘成曲线图。
然后取2mL的待测蛋自质溶液,用0.9%的NaCI溶液稀释至10mL,按上述方法测定279
m处的吸光度值。平行测定三次,取平均值后在标准曲线上查找对应浓度。总结:本文只是简单介绍了高效液相色谱法和紫外吸收法在蛋白质测量中的应用,但其实蛋白质的测量方法有很多,比如其他的化学方法:如凯氏定蛋法、等电点沉淀、法双缩脲法、考马斯亮蓝染色法等。各种方法原理不同,灵敏度不同,适用范围也不同,我们可以根据自己的不同用途来选择最适用的方法或几种方法结合来达到自己的检测目的。
参考文献:1.李宁02013203几种蛋白质测定方法的比较山西农业大学学报167181512006
f2唐玲玲夏明高效液相色谱法在蛋白质分离检测中的应用农产品加工学刊第l期总第160期3赵良娟液相色谱和加压毛细管电色谱分r
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