实验二十四外周血单个核细胞的分离Separatio
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peripheralblood免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。外周血单个核细胞PBMC的分离主要有两种方法，即聚蔗糖泛影葡胺FicollHypaque分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶Percoll分离法。此处只介绍聚蔗糖泛影葡胺分离法。【实验原理】血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖Ficoll和泛影葡胺Hypaque按一定比例混合制成，20℃密度为1077±0001，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其密度为1050～1077，而粒细胞和红细胞的密度为1080～1110。将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。【主要试剂和器材】1聚蔗糖泛影葡胺分层液密度为1077±0001。25gL台盼蓝。3250Uml肝素溶液用Ha
ks液配制。4Ha
ks液。5注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。6水平离心机、显微镜。【操作方法】1抽取静脉血2ml，注入含有02ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。再加入等量Ha
ks液混匀。2取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。稀释血液与分层液的容积比例以2∶1～3∶1为宜。3置水平离心机中，2000rmi
离心20mi
。4离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层含血小板和破碎细胞。5用滴管直接吸出单个核细胞层，或吸去血浆层后再吸了该层，置于另一离心管中。6加入4倍量以上的Ha
ks液，充分混匀，1000r／mi
离心l0mi
。离心后倾弃上清液，再用Ha
ks液洗2次。7用含10～20灭活小牛血清的Ha
ks液或培养液配制细胞悬液。计数，并分别计数粒细胞和单个核细胞数，同时用台盼蓝检测细胞活力，最后按实验要求将细胞悬液调整到适当浓度。【结果判断】
【注意事项】1将血液进行稀释可降低血液黏稠度和红细胞的聚集，提高单个核细胞的收获量。2温度变化可直接影响分层液的密度，即影响细胞的收获率和纯度。故应在室温18～25℃下进行实验，分层液使用前应预温至室温。温度过低，淋巴细胞丢失增多；温度过高，会影响淋巴细胞活性。
f3分离时的转速与时间应根据不r