变异株的研究等位基因特异PCR检测乙肝病毒G1896A变异株的研究
摘要〕〔摘要〕目的研究和评估反义抑制PCR检测乙型肝炎病毒HBV基因前c区1896位：点变异株的方法。方法根据HBVDNA前C区1896位点碱基的突变设计一系列引物，其中方法之一是针对该HBVDNA1896位点野生型碱基的反义引物PCR扩增时通过对1896位点野生型碱基序列的竞争性抑制而阻滞野生株DNA的扩增从而仅对HBVDNA1896位变异的碱基序列扩增特异性检测变异株。为了评估该方法的特异性，使用限制性内切酶方法对检测结果进行对比。结果该方法检测HBVG1896A变异株具有特异性，而且检测的最低值可达5结果×104IU／ml。与限制性内切酶方法检测比较经统计学处理卡方检验评价两者无显著意义。结论本法在对HBV临床标本1896位点变异株检测中特异和灵敏，是一种有效的检测方法。关键词乙型肝炎病毒；基因变异；聚合酶链反应乙型肝炎病毒核酸G1896A变异是指乙型肝炎病毒基因组核苷酸序列的第1896位核苷酸碱基由鸟嘌呤（G）变异为腺嘌呤A。该变异使前基因组RNA结构更稳定，更有利于病毒复制，并可导致优势毒株这是HBV最常见的变异，具有重要临床意义。本研究在等位基因特异性PCRASPCR扩增检测HBVDNA前C区1896位突变的基础上作了改进，使该方法利用野生型的反义引物抑制野生型HBVDNAPCR扩增能有效的检测1896位变异株。1材料与方法11试剂材料来源DNA聚合酶、引物、荧光探针等试剂购置，以及乙型肝炎病毒G1896A突变和野生型克隆株建立由上海闪晶生物技术有限公司制备。12引物和荧光探针设计和合成查Ge
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k编号AB198078、AP011095、AB485810比较和确定HBV全核苷酸序列并设计G1896APCR扩增靶基因核苷酸序列进行引物和荧光探针TaqMa
设计。表1HBVDNAG1896A检测引物和荧光探针TaqMa
设计的核苷酸序列序号123引物名称HBVY1HBVT1HBVYT2DNA序列5＇GCTGTGCCTTGGGTGGCTTTG3＇5＇GCTGTGCCTTGGGTGGCTTTA3＇5＇CCAGGTGGCCAGATTCATCAAC3＇
１
f4567
HBVFHBVR1HBVR2荧光探针
5＇CAAAGCCACCCAAGGCACAGC3＇5′CAAGCTGTGCCTTGGGTGGCCTT3′5＇GTCGAGGAGATCTCGAATAG3＇FAM5＇TATCGGGAGGCCTTAGAGTCT3＇TAMARA
注HBVY1为野生型上游引物HBVT1为突变型上游引物HBVYT2为野生和突变型下游公用引物HBVF野生反义上游引物HBVR1为限制性内切酶使用上游引物HBVR2为限制性内切酶使用的下游引物。1313HBV1896RFLP试验因对HBVG1896A变异株与野生株同时存在一个样本的PCR扩增产
物DNA测序方法不能区别所以用限制性内切酶方法对该序列分析作本方法特异性进行比较的标准r