Wester
blot操作步骤
实验原理：
Wester
blot，也称Wester
blotti
g、蛋白印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Wester
blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE），被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
内参
WB过程监测以及目的蛋白定量的标准；最重要和最不可或缺的对照就是内参照。
1内参可检测整个WB实验过程及体系是否正常工作，如果一个实验连内参照都出不了阳性结果的话（在内参抗体有效的情况下），那么这个体系就是存在问题的；
2、起半定量的标准的作用，内参一般选择管家基因编码表达的蛋白，在很多组织和细胞中都是稳定表达的，因此可以作为检测靶蛋白表达量的标准；
内参名称betaacti

分子量大小43kDa
适用范围胞浆和全细胞
fGAPDHTubuli
VCDA1Pori
COXIVTBP
3040kDa55kDa31kDa16kDa38kDa
胞浆和全细胞胞浆和全细胞线粒体线粒体细胞核
实验步骤一、蛋白样品制备（组织中总蛋白的提取）
第一步：法（1）敲取00701g组织400500ul裂解液，放入打样管，放入打样机打样。法（2）实验室研钵研磨：取稍大于01g的样品放入研钵中，加少量液氮冻硬，用研杵来回研磨至粉末状，用枪头刮取收集入离心管。注：任何操作都要在液氮中进行，并且要将枪头和离心管提前泡在液氮中。
第二步：取出的样品放置冰上12h（中间混匀56次）直至裂解完全。第三步：样品离心×2，取上清于新的EP管中。（离心条件：13000rpm，4℃，30mi
）
f注：离心机提前预冷至4℃。二、蛋白含量的测定
第一步：在96孔板第一列18分别为浓度为0，1，2，4，6，8，9，10倍的蛋白标准液水10或20ml，再加上5倍稀释的考马斯亮蓝染液200ml。
第二步：在96孔板后面几列依次加入稀释的蛋白样品或原液1020ml以及5倍稀释的考马斯亮蓝染液200ml。注：原液浓度太高时进行稀释，用裂解液稀释。三、电泳
第一步：清洗玻璃板将玻璃板在蒸馏水下冲洗干净，去除杂质，再用去离子水清洗一遍，自然晾干。
第二步：配胶（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶。（2）配分离胶，加入TEMED后立即摇匀即r