综合性、设计性实验项目教学讲义
实验项目名称：难降解化合物的微生物降解综合性实验所涉及综合知识或相关课程：环境微生物学计划学时：30适用专业：环境工程、环境科学实验性质：综合大纲审定人：
一、实验目的与要求
1、掌握化合物降解菌的筛选过程2、掌握几种培养基的配制方法3、掌握菌种初步鉴定的方法4、了解多氯联苯的测定方法
三、实验内容提要
在自然条件下，能降解难降解性有机污染物质的微生物数量少且活性低，因此在某些特殊污水处理的工艺中，通常是先将这部分细菌筛选出来，通过添加营养、控制条件进行专门的富集和驯化，然后把它们加到难降解性有机污染物的污水处理系统中以提高处理效果。
四、实验步骤及结果测试
1、样品的采集与保存土壤样品的采集：在野外采集新鲜土样（被污染过的土样），带回实验室后分装，冰箱保存备用。2、培养基的配制与灭菌：原料称量溶解调pH过滤分装包扎灭菌。3、PCBs溶液的配制：称取001gPCB77标准品，用丙酮定容至100ml，备用。4、菌种的分离、筛选富集及检测1菌种的分离：称取5g污染土样加入装有20ml无菌水的50ml离心管中，振荡30mi
，离心分离。用移液管移取振荡后的上清液10ml至装有新鲜基础盐培养液的三角瓶内，至使最终体积为100ml，使菌落不断扩增，一周转接一次，投加的PCBs的量依次增大（每周增加1ppm，即10mlPCBs溶液，最终加至2ppm）。稀释菌液，稀释浓度分别为CK、101、102、103……1011，采用涂布法分离（可用四线三区法划线分离）并挑取单菌落。2菌种的筛选富集：在基础盐培养基中加入一定浓度的PCBs溶液，根据光密度（OD600）值筛选生长态势较好的菌株，最终选出1株生长态势最好的菌株进行对PCBs的降解研究。再次把单菌落投加到基础盐培养基中进行纯化培养。最后在牛肉膏蛋白胨培养基富集扩大培养。3）光密度（OD600）值的测定：以未加菌的基础盐培养基为对照，分别对上述加菌的基础盐培养基测定其光密度（OD600）值。4）菌种的检测：进行革兰氏染色，观察菌种大小、形态。5、菌悬液的制备无菌条件下加入2mL090％无菌生理盐水于培养48h的菌种培养皿平行振荡，并用接种环轻轻刮取表面的菌落，即成粗制菌悬液，将其转移到液体培养基中30℃培养48h。将取出的发酵液立即在4000rmi
下离心10mi
，收集湿菌体，用无菌生理盐水洗3次，然后用无菌生理盐水与湿菌体混匀，控制菌体浓度为每毫升约109个。制得的菌悬液4℃保存备用。6、微生物对PCB77的降解
f高效菌种降解PCB77的r