聚焦显微镜光害、增加灵敏度和穿深的技术改进。直到1990年，双光子显微镜应运而生。
二、双光子显微镜的原理及技术特点
1931年，原子物理学家MariaGoeppertMayer预言一个分子或原子可以在同一个量子过程中，同时吸收两个多个光子而成激发态，即所谓的双多光子激发（吸收）。1961年，Kaiser等借助激光在CaF2∶Eu2晶体中首次观察到了双光子激发现象。1990年，Wi
friedDe
k利用双光子激发改造激光共聚焦显微镜，发明了双光子显微镜。
f什么是双光子激发？这要从产生荧光的机理讲起。在普通状态下，基态荧光分子吸收一个激发光的光子后，其电子被激发到一个能量较高但不稳定的激发态。激发态电子随即回到基态，同时将多余的能量以发射光子的方式放出，这就是单光子激发。由于整个过程中存在非辐射的能量损失，发射出的光子能量总是要小于激发光子，也就是发射光的波长大于激发光。而在双光子激发的情况下，荧光分子可以连续吸收两个波长为原来两倍的激发光子来产生与单光子激发同样的效果。例如在单光子激发中，NADH酶分子吸收一个350
m光子，发射出一个450
m光子；而在发生双光子激发时，吸收两个700
m光子，也可以发射出一个450
m光子。同理，也可有三光子激发乃至多光子激发，但更难发生。
f双光子激发的条件非常苛刻。荧光分子在吸收了第一个激发光子后，等待吸收第二个光子的中间态只能维持1017s（001fs），这要求激发光束中相邻两个光子的间隔必须小到1018s（1as）才能确保发生双光子激发，换算成激发光的功率密度高达5×1012Wcm2。任何生物标本都无法经受如此高功率的激光照射。为了解决这个问题，双光子显微镜普遍使用可调谐的锁模红外激光器输出飞秒级的脉冲激光。每个激光脉冲长约1013s（100fs），强度足够发生双光子激发，而两个脉冲间有108s（10
s）的间隔，使整个光束的平均能量密度下降到略高于普通共聚焦激光的水平。
f双光子激发对激发光能量要求极高，所以只能在光子密度最高的物镜焦点周围发生。相对于整个光路上都产生荧光的单光子激发，双光子激发很少产生焦平面以外的杂散光，因此：1）双光子显微镜可以不需要针孔，提高了荧光信号收集率，灵敏度随之得到提高；2）双光子显微镜的光毒性和光漂白仅发生在焦点周围的极小区域（约1um3），非常适合对活细胞、活组织的长时间成像观察。
f光线在介质中的散射能力与波长四次方成反比，因此双光子激发使用的近红外波段激光在厚样本中不易被散射、损耗，穿透力远强于普通共聚焦激光。在一般情况下，r