细胞凋亡检测方法
作者北京大学人类疾病研究中心
陈英玉
内容来自生物谷
细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式根据死亡细胞在形态学生物化学和分子生物学上的差别可以将二者区别开来细胞凋亡的检测方法有很多下面介绍几种常用的测定方法一细胞凋亡的形态学检测根据凋亡细胞固有的形态特征人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法1光学显微镜和倒置显微镜1未染色细胞凋亡细胞的体积变小变形细胞膜完整但出现发泡现象细胞凋亡晚期可见凋亡小体贴壁细胞出现皱缩变圆脱落2染色细胞常用姬姆萨染色瑞氏染色等凋亡细胞的染色质浓缩边缘化核膜裂解染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态2荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况常用的DNA特异性染料有HO33342Hoechst33342HO33258Hoechst33258DAPI三种染料与DNA的结合是非嵌入式的主要结合在DNA的AT碱基区紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光Hoechst是与DNA特异结合的活性染料储存液用蒸馏水配成1mgml的浓度使用时用PBS稀释成终浓度为25mgmlDAPI为半通透性用于常规固定细胞的染色储存液用蒸馏水配成1mgml的浓度使用终浓度一般为051mgml结果评判细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期Ⅰ期的细胞核呈波纹状rippled或呈折缝样creased部分染色质出现浓缩状态Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚边缘化Ⅱb期的细胞核裂解为碎块产生凋亡小体图1
3透射电子显微镜观察结果评判凋亡细胞体积变小细胞质浓缩凋亡Ⅰ期proapoptosis
uclei的细胞核内染色质高度盘绕出现许多称为气穴现象cavitatio
s的空泡结构图2Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚边缘化细胞凋亡的晚期细胞核裂解为碎块产生凋亡小体
二磷脂酰丝氨酸外翻分析A
exi
V法磷脂酰丝氨酸Phosphatidylseri
ePS正常位于细胞膜的内侧但在细胞凋亡的早期PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面暴露在细胞外环境
f中图3A
exi
V是一种分子量为3536KD的Ca2依赖性磷脂结合蛋白能与PS高亲和力特异性结合将A
exi
V进行荧光素FITCPE或bioti
标记以标记了的A
exi
V作为荧光探针利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生碘化丙啶propidi
eiodidePI是一种核酸染料它不能透过完整的细胞膜但在凋亡中晚期的细胞和死细胞PI能够透过细胞膜而使细胞核红染因此将A
exi
V与PI匹配使用就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来
方法1r