制同步；③碱基要随机分布，引物自身不能有连续4个碱基的互补，防止自身形成发夹式结构，影响扩增
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效率；④两个引物之间不能有稳定的二聚体或发夹式结构存在；⑤引物不能在别的非目区域引起高效的DNA聚合反应（错配）问题4在PCR技术操作中，为何加的引物中C、G比例越高，退火温度越高？两个引物中的G、C比值差异不能太大？引物的一个重要参数是熔解温度（Tm）这是当引物和互补序列配对为双链DNA分子时的温度Tm对于设定PCR退火温度是多少必需的参照的值在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效配对，同时还要足够高，以减少引物与其它非感兴趣的部分进行非特异性结合的配对合理的退火温度一般在55℃左右，退火温度一般设定比引物的Tm低5℃设定Tm值有的是根据引物中G、C含量估算，确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法，即开始以低于估算的Tm低5℃，再以2℃为增量，逐渐提高退火温度，较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产生的形成，从而保证了DNA分子延伸过程中的顺利性与正确性G、C含量影响退火温度是因为碱基对之间的结合三个氢键，A、T对之间有两个氢键，打开这些碱基对所需的能量不一样，所以引物中C、G比例越高，退火温度越高为获得最佳结果，设计的两个引物应具有近似的Tm值若由于DNA分子两端序列的特异性而导致引物对的Tm差异较大，为了提高特异性可以根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后再根据较低Tm值设计的退火温度进行剩余的循环，这可以使得在较为严紧的条件下获得目的模板的部分拷贝问题5为什么细胞内DNA复制的引物是RNA？PCR的引物是DNA？细胞内DNA分子复制过程可概括为：（1）双链的解开；（2）RNA引物的合成；（3）DNA链的延伸；（4）切除RNA引物，填补缺口并连接相邻的DNA片段迄今为止，无论在原核生物还是在真核生物中所发现的DNA聚合酶，都必须有模板链和3′OH末端的引物链存在，才能合成新的DNA链（由5，3，方向延伸）这就需要在DNA复制起始阶段由RNA聚合酶首先合成一小段RNA为引物，RNA引物就提供了这个羟基，DNA聚合酶III才会真正开始DNA链的合成在细胞中只有RNA聚合酶可以从头合成RNA，合成的RNA与模板链结合，从而引导DNA分子子链的延伸而DNA聚合酶由于它的保真系统决定它不能从头合成DNA单链，所以DNA复制时先由RNA聚合酶合成一段RNA链，再由DNA聚合酶起到DNA分子复制时的延伸功能，形成互补的子链再从DNA分子r