毕业设计(论文)开题报告
小鼠解剖、DNA采集与提取、引物设计、基因片段PCR,琼脂糖凝胶电泳
拟解决的主要问题:
作为导师研究课题的一部分,完成基因型鉴定后为后续实验奠定基础。
三、研究方法及措施(拟采取的研究手段及技术路线、实验方案等)
1、小鼠解剖:(1)准备实验工具(PBS缓冲液、培养皿、解剖工具等);(2)捏住母鼠尾巴中部将母鼠提起,置于鼠笼上,用颈椎脱臼法处死;(3)用75酒精喷壶喷湿母鼠腹部皮毛,在培养皿中倒入PBS缓冲液;(4)用镊子提起母鼠腹部皮肤,用剪刀横向剪一个创口,撕开;(5)用剪刀剪开腹腔膜,用镊子取出子宫,移至培养皿中;
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(6)在体视显微镜下操作,用镊子撕开子宫及羊膜,分离胚胎;
(7)将胚胎移至干净PBS缓冲液中,剪尾做DNA提取;
2、DNA采集与提取:
DNA采集
(1)剪取小鼠尾巴约03里面置EP管备用;
(2)解剖小鼠取视网膜、内耳、血液、心肌、皮肤等组织部分置EP管备用。
DNA提取
方法一:碱裂解法
(1)剪取03厘米小鼠尾于15mlEP管
(2)加入100ul50MNaOH
(10mlstockof50mMNaOH995mlddH2050ul10NNaOH)
(3)95℃加热10分钟,涡旋
(4)加入10ul1MTris(PH80),涡旋
(5)12000g离心5分钟
(6)加入100ulTE(PH80)
方法二:蛋白酶消化
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(1)剪取03厘米小鼠尾于15mlEP管(2)加入400ulTaildigestio
buffer及25ul10mgmlprotei
aseK(3)60℃加热,过夜(4)加入200μl酚氯仿异丙醇溶液,涡旋至乳白色,14000g离心5分钟(5)吸取300ul上清液至新EP管,加入900ul100乙醇,摇动46次,
14000g离心1分钟(6)倒去上清液,加入350ul75乙醇,14000g离心1分钟(7)倒去上清液,自然风干(8)加入50ulTE(PH80)
蛋白酶k是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶,是枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶,从林伯氏白色念球菌(tritirachiumalbumlimber)中纯化得到,用于生物样品中蛋白质的一般降解。
3、引物设计:本次实验所用引物由美国罗切斯特大学甘霖教授完成。4、基因片段PCR:(1)高温变性(95℃)
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f(2)低温退火(60℃)
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(3)室温延伸(72℃)
5、琼脂糖凝胶电泳:
(1)配制1XTAE缓冲液(附录)
(2)制作琼脂糖凝胶:根据引物大小配制(600bp以下2,600bp以上15)
例:制作2凝胶100ml
电子天平称取琼脂糖2g于锥形瓶中,加r