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一、样品制备1、取样(大约1×106cells),离心弃上清,以PBS洗两遍,逐滴加入1ml70的冷乙醇固定细胞,20℃冻存过夜。分析时,离心弃上清,以PBS洗两遍,加入100μl的R
ase(Ge
Script试剂A),37℃水浴30mi
,然后再加入400μl的PI染液(Ge
Script试剂B),在4℃避光条件下孵育30mi
后即可上FCM检测。每个样品至少获取2×104cells,二、上流式测细胞11、打开液流抽屉,确认气压阀处于减压状态;打开金属挡板;取出鞘液桶,倒掉废液,将鞘液桶加至23满(一般可用三蒸水,做分选必须用PBS或FACSFLow),拧紧鞘液桶盖,安上金属挡板,保证管路畅通无扭曲。检查废液桶,将废液桶的气路和液路的快速连接阀打开,倒掉废液(加鞘液一定要倒废液)向废液桶中倒入400ml浓度为10的次氯酸钠溶液,合上压力阀。确实盖紧桶盖,检查所有管路是否妥善安置。12、依此接通电源、打开稳压器电源(指示灯由bypass变Acputput)、变压器电源,稳定5分钟。将FACSCalibur开关打开,此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY。如果需要打印,打开打印机电源。打开电脑(密码:BDIS),等待屏幕显示出标准的苹果标志(先开仪器,后开电脑主机)。13、将压力阀置于加压位置,轻拍过滤器,使气泡位于滤器的上方,打开管路开关,将过滤器中的气泡排除,关闭管路开关。若滤器管路中有气泡,打开连接头,挤出鞘液,以排除气泡。关闭液流抽屉。执行仪器PRIME功能一次,以排除Flowcell中的气泡(反向压力使鞘液从进样针中流出)。结束后自动STANDBY,5分钟后即可进行试验。21、从苹果画面中选取CELLQuest,最大化,选散点图标,打开,Plottype选择Acqa
alysis,X参数和Y参数分别取FSCH、SSCH(选择散点图主要是确定所需细胞的细胞群)。选择单参数图标,打开,Plottype选择Acqa
alysis,X参数选择FL2H1024此属于荧光根据荧光染料的波长范围选择不同的荧光本实验使用PI作为荧光染料故选择FL2H
f22、从屏幕上方Acquire指令栏中,选取Co
ecttoCytometer(快捷键:+B)进行电脑和仪器的连机。此时出现Parameterdescriptio
对话框选择BDfiles设置文件存放的位置在Acquire指令栏中,选择ParameterDescriptio
,以决定文件存储位置folder,文件名称file,样品代号以及各种参数的标记pa
el,即安排tube1,2,3…的检测参数。一般本仪器获取的数据按照检测对象的不同分别储存于FACStatio
G3BDApplicatio
sCELLQuestXXX和DNA文件夹中。文件根据日期命名。同时将出现的Acquisito
Co
trol对话框将其移至合适位置。23、从Cytometer指令栏中,开启DetectorsAmps,Threshold,Compe
satio
,Status等四个r
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