蔗糖是重要的光合产物,是植物体内运输的主要物质,优势碳水化合物的暂贮形式之一。蔗糖合成酶(SS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)是植物体内催化蔗糖合成的两种酶。对这两种酶活性的测定,可以了解植物组织合成蔗糖能力的高低。
【实验原理】蔗糖合成酶催化游离果糖与葡萄糖工体UDPG反应生成蔗糖。UDPG果糖蔗糖UDP这是一个可逆反应,平衡常数为1320。该酶在分解方向的Km值相对较高(30150mmolL),细胞中高的蔗糖浓度有利于反应向分解方向进行。蔗糖合成酶活性测定既可在合成方向进行测定(外加底物UDPG和果糖,测产物蔗糖的量表示酶活性),也可以在分解方向进行测定(外加蔗糖和UPD,测定果糖含量表示酶活性)。蔗糖磷酸合成酶(SPS)催化UDPG与果糖6磷酸(F6P)结合形成磷酸蔗糖:UPDGF6P蔗糖6PUDPH6磷酸蔗糖可以经磷酸蔗糖酶(SPP)水解后形成蔗糖。实际上最近有证据证明SPS和SPP可以在体内形成一个复合体,因此使得SPS催化的反应基本上是不可逆的。酶活性测定是外加UDPG和F6P,测定产物蔗糖的量表示酶活性。一般把SPSSPP系统看作是蔗糖合成的主要途径,而把蔗糖合成酶看作是催化蔗糖分解的。果糖是酮糖,可与间苯二酚混合加热反应生成红色产物,在一定范围内糖的含量与反应液颜色成正比。蔗糖在含有盐酸的间苯二酚中水解成葡萄糖和果糖,也能生成红色产物,在480
m处可比色测定。【实验材料】植物茎【仪器设备及设备】冷冻离心机,恒温水浴,分光光度计,研钵一套,磁力搅拌器,天平(感量001mg),
f01、05、1、5ml移液管各1个,10ml具塞试管10支,5ml量瓶一个,冰箱
【试剂药品】1提取缓冲液:100mmolLTrisHClPH70缓冲液,内含5mmolLMgCl22mmolLEDTANa22乙二醇,02牛血清蛋白(BSP),2PVP,5mmolLDTT。
1molL二硫苏糖醇(DTT)溶液【配制方法】用20ml001molL乙酸钠溶液(pH52)溶解309gDTT,过滤除菌后分装成1ml小份贮存于20℃。
2透析缓冲液:25mmolLTrisHClPH70缓冲液,内含25mmolLMgCl21mmolLEDTANa21乙二醇,1mmolLDTT。
3酶反应液:100mmolLTrisHClPH70缓冲液,内含10mmolL果糖(10molL果糖6磷酸代替果糖)2mmolLEDTANa25mmolL醋酸镁,5mmolLDTT。
5mMTrisHCl配法:50毫升01M三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液与457毫升01M盐酸混匀后,加水稀释至100毫升。这是pH71的您要70的话便再加一些HCl用pH计调到70。50mMNaClpH70配法:端直称292gNaCl,加水到1L然后用01M盐酸或者01MNaOH调pH到70
410mmolLUDPG称取0012206gUDPG,配成2ml,浓度计为10molLUDPG随配随用。尿r