淋巴细胞增殖计划
一、主要溶液的配制：主要溶液的配制：1Tris破红液：1TrisNH4CL破红液：称取412克Tris溶于160mlDDW中，盐酸862ml100ml调节PH至765大约需2ml，1M为A液；称取83克NH4CL溶于1升DDW中，为B液。使用前B与A以9：1混合，盐酸调PH至72。2moll）2RPMI1640液（谷氨酰胺2moll）：带酚红试剂的1640液（用酒精擦瓶口，并在酒精灯上过一下，遇空气变碱），将其分装成50ml离心管内（每次大约需3管），加10％的灭活胎牛血清，Hepes10mM青霉素10UL，链霉素10UL。注：虽1640液中含有Gl
，但开瓶后极易挥发，故一定加入Gl
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储存液浓度胎牛血清青、链霉素Hepes100％1万Uml1M
应用浓度10％100Uml10mM
每10ml培养基中应加量9＋1ml100μl100μl
以上混匀后用75NaHCO3调PH至7072（无需调节，PH718）现用现配。二、实验步骤：实验步骤：1．动物准备BALBc小鼠，20g左右，四只。实验组：2只（d0天，d3天，d5天上午腹腔注射氢化可的松10mgkg，下午腹腔注射环磷酰胺30mgkg）对照组：2只（与实验组相同时间点腹腔注射生理盐水）2RPMI1640液分装后，配制完全1640液（每次10ml），调节PH。TrisNH4CL每次10ml调节pH后022μm滤器过滤。3BALBc小鼠断颈处死后，75％酒精浸泡3－5分钟。4在超净工作台内，垫一酒精纱布，剪刀、镊子无菌取脾，（每组小鼠两个脾合在一起）在一个培养皿内用培养液冲洗后，转移至另一个含10mlRPMI1640液的培养皿中，200目金属网中央浸没于液体中，用玻璃注射器芯研磨组织碎片，使分散的细胞滤过金属网进入平皿的液体中。
f5用1mlTip头将细胞悬液转移到15ml试管中，待结缔组织自然下沉后，将上清移入到另一个15ml离心管中，用吸管轻轻吹打，水平离心，1200rpm10分钟。弃上清。6破红：将细胞沉淀按1：10加入TrisNH4CL破红液轻轻吹打混匀，室温放置5分钟。水平离心1200rpm10分钟。弃上清留取细胞沉淀。7洗涤：将沉淀的细胞液重悬于14ml的RPMI1640液中，吹打混匀，1200rpm离心10mi
。8弃掉上清，将残留的RPMI1640用尖吸管吸干，将细胞重悬于2mlRPMI1640中。计数板计数：用酒精擦计数板和盖玻片，然后用绸布轻轻擦拭。取少量细胞悬液用RPMI1640液将其稀释100倍，用吸管轻轻吹打混匀后，取15μl滴入计数板内，置于显微镜下计数。细胞压中线时，只左不右，只上不下。细胞数ml4大格细胞数之和4×10×稀释倍数1009将上述液体水平离心，1200rpm10分钟。用完全培养液调整细胞浓度为5×10ml与15×10ml。分组如下：Co
A终浓度r