然后用农杆
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f菌介导法转移到大果猕猴桃品种中,现已得到一个果重70g以上的红肉猕猴桃,这是世界上第一个有实用价值的转基因经济林木。除此之外,目前利用该方法还在苹果、葡萄、扁桃、杏、树莓、黑茶子、美洲山核桃、柑桔、芒果、杂交山杨、桉树、日本柿、番木瓜、橡胶树等经济林木中获得转基因植株。
应用农杆菌介导法的前提条件为:①具有对转化植物敏感的去除致癌区DNA(TDNA)并携带外源基因的农杆菌工程菌种;②具有方便可行的筛选转化细胞的选择标记基因;③理想的植物受体材料。为此,近年来基因转化技术研究的重点为如何建立和完善再生体系和提高基因转化频率,其中较为集中研究的方面有:①提高农杆菌侵染力。Da
dekar等在苹果上研究发现,不同农杆菌株系致病能力差异很大。而农杆菌对寄主细胞的致病力主要受其携带的原质粒上的Vir区的6组基因(VirA、B、C、D、E、G)控制。筛选适宜的菌种对提高目标植物的转化成功率至关重要。研究者还发现,一些生理生化因素,如乙酸丁香酮(ace-tosyi
go
e)、甜菜碱(betai
ephosphate)、PH、温度、渗透压等通过调节Vir区基因来影响农杆菌致病力。②选择最佳受体材料。理想的受体材料其细胞既能与农杆菌直接接触,又能由单细胞分化再生植株。目前常用的外植体有叶片、茎段、原生质体、下胚轴、无性胚等,而以叶片应用最为广泛。③适宜的诱导和选择条件。筛选剂种类、筛选剂浓度、筛选时间、培养基基质等都会影响到转基因细胞的分化和再生植株。
2、生物弹射击基因转化生物弹射击法(BiolisticSystem),又称“基因枪”法(Ge
egu
bombardme
t),也称粒子轰击法(Particlebombardme
t)或高速粒子微喷射技术(Hightvelocityparticlemicroprojectio
),是一种机械转移基因的方法。采用加入Ca2的亚精胺等使外源DNA吸附在钨金微粒表面,制成DNA微弹,在基因枪激发的瞬间力量作用下,将外源基因直接导入植物细胞中。
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f生物弹射击法基因转化的最突出的优点是其应用的广泛性。这种方法将来可能成为一种“万能”基因转化法。它和农杆菌介导法不同之处在于它不只限于某些植物,而排斥另一些植物。在生物弹射击法发明(1987,Sa
ford)后的短短几年内,该法已成功地应用于高等植物(被子植物和裸子植物)、蓝藻、细菌、真菌、动物离体细胞和活体细胞组织。该法另一个优点是将外源DNA可以直接导入可再生的组织或细胞,因此不需要培养原生质体。
生物弹射击法已在多种植物上应用成功,经济林木上仅在番木瓜(Caricapapaya)、蔓越桔(Vecci
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