安徽农业科
学2001296746749
2王靖黄云李小兰黎怀忠
十字花科根肿病研究进展植物保护20ll，376：153
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f研究内容
1探讨十字花科蔬菜根肿病发生与土壤含水量的相关性。
2土壤含水量对白菜根肿病发生的影响试验研究。
拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析
取无根肿病菌的草炭土（即灭菌培养土），过筛压碎晒干，在烘箱内烘烤72h左右直至烘干取出备用。为保证土壤含水量，实验前用塑料膜堵住孔口，称取经烘烤的土样130g盛入塑料盆中，表面平铺20g晒干的菌土，播入易感病品种，逐一将土壤含水量调整为20、30、40、50、60、70、80，共8个处理，3个重复，每一个重复为≥20株苗，其加水量分别为30g、45g、60g、75g、90g、105g、120g，置于温室培养。每隔1d称重，补水保持各处理的土壤含水量，同时保证其它环境条件的一致性（图1）。PCR定性检测发芽当天和发芽后18d的侵染情况，定期取根并用苯酚苯胺蓝溶液染色观察根毛侵染情况，播种后第35天观察病情指数。技术路线：DNA提取方法：1配制裂解缓冲液；2称取05g左右肿根于研钵中，加入1ml裂解缓冲液浸浴10mi
后再进行研磨；3将研磨液转入15ml离心管，加入150μl醋酸钾溶液；4将离心管振荡片刻后，12000×g离心2mi
；5将上清液转入另一15ml离心管中，12000×g重复离心一次；6取上清液加入等体积氯仿：异戊醇，5000×g离心8mi
；7取上清液加入等体积预冷的异丙醇，简单混匀，置于常温下20mi
左右，至看到絮状沉淀为止；812000×g（11000）离心2mi
（4mi
）；弃上清，沉淀用70乙醇冲洗23次，并在10000rmi
下离心1mi
；9弃上清，沉淀风干后溶于TE。PCR检测方法：采用博迈德生物公司生产的2×TaqPCRMasterMix进行PCR检测。引物：pb1b：5’GTGGTCGAACTTCATTAAATTTGGGCTCTT3’pb2b：5’TTCACCTACGGAACGTATATGTGCATGTGA3’。体系：模版DNA（1ul）、引物pb1b、pb2b（各1ul）、2×TaqPCRMasterMix（125ul）、ddH2O，共25ul。反应程序：第一步，94℃预变性2mi
；第二步，94℃变性30s；65℃退火1mi
；72℃延伸1mi
，共45循环；第三步，72℃延伸10mi
。（Tiese
Cao等，2007年）。1琼脂糖凝胶电泳检测：取5μlPCR产物，在TAE缓冲液中用10琼脂糖凝胶电泳，120V恒压下电泳约30mi
，至指示剂快到到凝胶板底部处停止电泳，经溴化乙锭（EB）染色后在紫外投射仪上进行观察。根肿菌PCR条带处于500bp750bp之间。
f研究计划及预期成果具体进度安排：2013年3月，查阅与本课题相关的国内外文献，明确课题研究内容的国内外进展；2013年5月，进行试验材料实验r