指示灯指向T,使透光率为0,盖上盖,使透光率为100,然后使指示灯指向A进行测量。8、要比较两杯的差异,提高结果的准确性。
f四、实验结果
A260装溶液的比色杯与另一个比色杯的差值溶液溶液的最终值000501180113
A28000040054005
A260A28001130050226dsDNA50A260稀释倍数5001133001695微克ml分析:1、采用机械研磨的方法,可破坏植物的组织和细胞,为了防止匀浆中各种酶类(尤其是氧化酶类),抽提缓冲液中的B巯基乙醇可降低这些酶类的活性,同时,在冰上研磨,有两方面的作用:、降低酶的活性,、使细胞中水结晶,细胞膨胀,(1)(2)利于材料的破碎。2、CTAN表面活性剂,能溶解细胞膜和核膜蛋白,使核蛋白解聚,从而使DNA得以游离出来。3、抽提缓冲液中的EDTA为金属螯合剂,能除去匀浆液中的Mg2和M
2,抑制DNA酶的活性。4、抽提缓冲液中的Nacl浓度很高,DNP易溶于高盐溶液,RNP在高盐溶液中溶解度不大,以分离DNP和RNP。5、氯仿能使蛋白质变性,同时有吸收匀浆液中色素的作用。异戊醇防止液相之间起泡,利于液相分离。这样DNA溶于上层CTAB抽提液中,细胞碎片在下层,变性蛋白质在中间。6、第2步的轻轻振荡,是为了防止DNA受破坏,3步的剧烈振荡是为了DNP中蛋第白质与DNA的分离。7、异戊醇一方面:除去CTAB,因为CTAB易溶于异丙醇,另一方面:沉淀DNA。8、离心后那可除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入预冷的乙醇使DNA沉淀,因为DNA难溶于乙醇冷的乙醇效果更佳。9、最后的TE缓冲液中含RNA酶,消化RNA。10、抽提缓冲液中TrisHcl使DNA保持天然的完整状态。11、DNA的吸收光谱峰在260
m处,据计算,测定此波长下DNA溶液的A值,当A2601时,双链DNA含量约为50微克ml,据此可用紫外分光光度计测定溶液中DNA含量。由于蛋白质的吸收峰在280
m处。如果A260A280在1820时,认为以达到较高的纯度,如低于此值其中蛋白质较多,如高于此值说明其中含RNA或DNA片段过多。12、本实验A260A28022620,很可能是DNA片段过多,因为本实验第5步没用剪短的枪头。13、比较两比色杯的差异,是因为比色杯可能不标准,会产生小的误差,通过记录两者的差异,然后通过结果相减可消除这种差异造成的影响。14、DNA溶液的浓度可用dsDNA50A260稀释倍数来算。
fr