《生物工程下游技术实验》讲义生物工程下游技术实验》
柯德森、广州大学生命科学学院柯德森、巫锦雄20102010年10月10日
实验项目一：超氧化物歧化酶的分离纯化技术”实验项目一：“超氧化物歧化酶SOD的分离纯化技术
共3个独立时间段每次6节课，第八周开始
实验一：植物超氧化物歧化酶（SOD）活性测量6学时实验一：植物超氧化物歧化酶（SOD）活性测量6学时
过程
1每组30g绿豆洗涤，蒸馏水浸泡过夜，倒去浸泡的水，加入300ml蒸馏水液，匀浆机匀浆，二层纱布过滤，离心（3000rpm）得清液，取少量清液进行SOD活性及蛋白质含量测量，计算材料中SOD总活性单位及比活性单位（u
itsmgPr）。所得清液测量其总体积，缓慢加入硫酸铵至40饱和度（查一般实验手册约226g100ml清液），5℃冰箱中静置备用下一实验。SOD活性的测定：（二种方法取一种，本次实验用前者，要求理解后者的原理）邻苯三酚自氧化法：这是最简单的一种检测方法，但干扰因素较多。NBT光化还原法：比较稳定，但受酚类物质干扰。
2
一、利用连苯三酚自氧化测SOD活性的方法
溶液配制：溶液配制：
1，连苯三酚：630mg→100ml10mmolLHCl0085ml36的浓HCl，用蒸馏水配连苯三酚：成100ml。共配500ml2，pH83050mmolLTricHClTricHCl：A01molLTris12114g1000ml储备液B01molLHCL浓盐酸稀释得到（85ml36的浓HCl，用蒸馏水配成1000ml）储备液005molLpH83500mlA199mlB定容到1000ml
操作：操作：
25°C，ml50mmolLpH830的TricHCL缓冲液，3加入10l50mmolL连苯三酚（具体加入量应每次测量前校正，加入的原则是使下面的A325变化控制在007／mi
左右），迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯应该用石英杯中，每３０秒测一次Ａ３２５值，自氧化速率的变化（Ａ）控制在007／mi
左右，加入酶液后再测连苯三酚自氧化速率的变化（Ａ’）酶量的加入控制在使加样后的Ａ’在0035mi
左右。，（以上ＡＡ’的变化值不需特别严格，Ａ只要控制在01以下004以上，Ａ’变化在Ａ的约一半左右即可）
f一个SOD活性单位（连苯三酚单位）：在以上条件下，加入酶如果在一分钟时间能抑制连苯三酚自氧化速率的一半，此时所加的酶量就为一个SOD的酶活性单位（u
it，U）。加入酶量相当的酶活力单位（u
it）＝ＡＡ’Ａ×２加入酶量相当的酶活力单位提取液的总活力（或材料总活力）（u
it）加入酶量相当的酶活力单位×反应液总体积取样液体积×稀释倍数比活u
itsmgPr总活r