值通常指在水缓冲剂中的测得值。如果HPLC流动相中含有有机溶剂，其pKa值可随B有所变化（见723节）。当一种化合物的pKapH时，其有一半解离（即流动相中B与BH的浓度相等）。几乎所有与pH相关的保留值变化均发生于pKa值±15单位的pH值范围内图72a的B（见图区域）。超出该范围（图72a中为pH25或pH55），该化合物或者完全解离或者完全未图解离，其保留值随pH变化不大（即保留行为与中性化合物相似）。该情况见图71所示，图当pH6时的化合物1，与pH7时的化合物2的情况。如化合物含有多个酸和或碱基，其RPC保留值与流动相pH的关系则更为复杂。当
1
f2
这些基团相同时（酸性或碱性），其保留值与pH的关系基本相似，如图73a中所示的一系图列含有一、二、五与七个可解离的酸性基团（COOH）的化合物（蝶酰基低聚）谷氨酸。而当一个分子中同时存在一个酸性和一个性碱基团时，（两性）保留行为更复杂，见图73b图所示的几种氨基酸的RPC分离。中间pH值处保留值最小，因为4pH8时，羧基与氨基都发生解离；这时分子解离程度最大，亲水性最强（尽管静电荷为零）。
40
5碱
保留体积（ml）
30
20
4碱
10
3中性1酸性357洗脱液的pH值2酸性9
对反相保留的影响与样品类型（中性）图71流动相pH对反相保留的影响与样品类型（酸、碱、中性）的关系
色谱柱：30×04cmμBo
dapakC18，流动相：0025M磷酸盐、40甲醇；化合物：1水杨酸；2苯巴比妥3非那西丁4尼古丁5甲基苯丙胺。
722缓冲液的选择当分离酸性或碱性样品时，加入缓冲剂控制流动相的pH是非常可取的。（用pH计）很难精确测定含有有机溶剂的流动相的pH，因为电极响应易发生漂移。因而，如使用pH计，最好先调节缓冲剂的pH，再加入有机溶剂。这就使最终流动相的实际pH值难以确定（因为加入有机溶剂会改变pH），但该问题比流动相pH重现性不好要大得多（即当加入有机溶剂后，再测pH值）。选择具体缓冲剂时，应切记的几种考虑因素：缓冲容量UV吸收度其它性质：溶解度、稳定性、与样品和色谱柱的相互作用、挥发性、对HPLC系统的腐蚀等。7221缓冲容量缓冲容量由pH、缓冲剂pKa及其浓度决定。与样品化合物的情况类似，缓冲剂发生解离的pH范围为pKa±15。只有在此pH范围内缓冲剂才能有效地控制pH值。因此，为了保险起见，为某具体分离所选择的缓冲剂应控制的范围pH≈pKa±1072b下的讨论）。假定进样体积较小和或样品对流动相pH的影响不r