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该序列的上游有其他的氨基酸。lacZ序列终止在3755碱基处。
11lacZ基因序列上游的氨基酸序列是否影响酶活力?不,上游的氨基酸序列对β半乳糖苷酶的活力无影响。
12pSVβ半乳糖苷酶载体是否含有完整的lacZ基因?
fβ半乳糖苷酶N端的6个氨基酸缺失,蛋白起始于第7个氨基酸。缺失的氨基酸不影响酶活力。
13lacY基因在载体上位于何处?LacY的起始密码子AUG位于3809bp,无编码框内的终止密码子,lacY与下游的SV40序列相连接,该序列包含有polyA序列。
14如何从pSVβ半乳糖苷酶载体上切割pSVβ半乳糖苷酶基因?质粒用Hi
dIII切割基因的上游,BamHI,SalI,PstII切割基因的下游。
15pSVβ半乳糖苷酶载体是否存在polyA区域?polyA信号位于4021bp到4156bp的区域内,在lacZ,lacY基因的下游,但在BamHI的上游。polyA信号来源于SV40小T抗原。这一区域与β半乳糖苷酶的稳定性无关,但可以有助于在哺乳细胞中增强β半乳糖苷酶mRNA的稳定性。
16作原位染色时,如何配XGal溶液?首先加入2XGal(DMF),再加入用PBS(137mMNaCl27mMKCl81mMNa2HPO4147mMKH2PO4)配制的2mMMgCl25mMK4FeCN63H2O5mMK3Fe3CN6,加入K4FeCN6后会产生沉淀,这不会影响活力,如有沉淀发生,则过滤除去沉淀。
17如原位染色后的颜色很浅,应再作哪些实验?细胞在XGal溶液中应保温更长的时间,不同的细胞染色的特点不同。固定的步骤也可通过增加或减少戊二醛处理的时间,将戊二醛的浓度降到005。一般细胞为浅蓝色,而阳性对照为深蓝色。
18未转染的细胞是否表达β半乳糖苷酶?是,必须用非转染的细胞作为阴性对照,非转染的细胞也会生色。
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