电泳工作原理
工作原理蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一电泳是指带电粒子在电场作用下向着与其电荷相反的电极移动的现象根据所采用的支持物不同有琼脂糖凝胶电泳淀粉凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳等其中聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE由于无电渗作用样品用量少1100μg分辨率高可检出1091012mol的样品凝胶机械强度大重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用SDSPAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量PAGE能有效的分离蛋白质主要依据其分子量和电荷的差异而SDSPAGESDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异因为SDSPAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇2ME或二巯基赤藓醇DTT其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键破坏蛋白质的四级结构SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂它可以断开分子内和分子间的氢键破坏蛋白质分子的二级及三级结构并与蛋白质的疏水部分相结合破坏其折叠结构电泳样品假如样品缓冲液后要在沸水中煮35分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS蛋白质复合物SDS蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化蛋白质也完全变性和解聚并形成榛状结构稳定的存在于均一的溶液中SDS与蛋白质结合后使SDS蛋白质复合物上带有大量的负电荷平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖远远超过其原来所带的电荷从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计消除了不同分子之间原有的电荷差别其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基样品处理液中通常加入溴酚蓝染料溴酚蓝指示剂是一个较小的分子可以自由通过凝胶孔径所以它显示着电泳的前沿位置当指示剂到达凝胶底部时即可停止电泳另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部重要参数①聚丙烯酰胺凝胶PAG制备原则由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度T以及双体占总浓度的百分含量即交联度C决定的因而制胶之前必须首先知道这两个参数一般可以由下述公式计算Tabm100和Caab100其中a双体bis的重量b单体arc的重量m溶液的体积ml②当分析一个未知样品时常常先用75的标准凝胶制成410的
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