实验一农杆菌感受态细胞的制备
［目的及要求］了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。
［实验原理］在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工
程菌株。在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。感受
态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA的一种特殊生理状态。农杆菌的感受态可用CaCl2处理而诱导产生。将正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl2溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大的影响。［实验仪器、材料和试剂］
一、仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml试管，50ml离心管，15ml离心管，冰浴，微量进样器及吸头。以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。
二、材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株三、试剂：YEB液体培养基（1L）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，
蔗糖5g，MgSO47H2O05g，pH70，高压灭菌。利福平（Rif）储液：50mgml20mMCaCl2，高压灭菌。［实验步骤］1、挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3ml的YEB液体培养基（含Rif50mgl）中，28℃振荡培养过夜；2、取过夜培养菌液1ml接种于50mlYEB（Rif50mgl）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为05；3、取2ml菌液，13000rpm，离心30sec弃上清；
f4、加入1000l20mMCaCl2，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30mi
；5、13000rpm，离心30sec，弃上清，置于冰上，加入500l预冷的20mMCaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24hr内使用，或液氮中速冻1mi
，置70℃保存备用。
实验二质粒DNA直接导入农杆菌
［目的及要求］了解和掌握质粒DNA转化农杆菌细胞的原理和方法，获得能用于植物转化的
工程菌。［实验原理］
在低温下，外源DNA（质粒）可吸附到感受态细胞表面，诱导细胞吸收DNA。（加入热激原理）转化了质粒DNA的农杆菌随后28℃恢复培养，可使质粒上携带的编码抗生素的抗性基因得到表达，因此，转化了质粒的农杆菌细胞可在含有相应抗生素的培养基上生长，而没有转化的细胞则无法生长。
植物真核表达载体pCAMBIA1300图谱
f［实验仪器、材料和试剂］一、仪器：超净工作台，恒温摇床，培养箱，台式离心机，水浴锅，高压灭
菌锅，70℃超低温冰箱，培养皿，微量进样器及吸头。材料：根癌农杆菌LBA4404（或EHA105）感受态细胞，质粒pCAMBAI1300SPRr